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近年来,包括病毒性偷死病（Viral covert mortality disease,VCMD）在内的多种新发疫病的大范围流行对中国对虾养殖产业造成了严重损失。偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus,CMNV）是引起对虾VCMD的病原,在流行病学调查中我们发现,我国养殖对虾中除了广泛流行的CMNV外,最近还出现了一种新型野田村病毒,这种病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）基因序列与CMNV Rd RP基因片段的相似性为78%,是一种不同于CMNV的新病毒。感染这种新型野田村病毒的养殖凡纳滨对虾多表现出游泳能力下降的症状,因此被暂命名为“行动障碍野田村病毒（Movement disorder nodavirus,MDNV）”。本研究拟在前期建立MDNV逆转录巢式PCR（RT-n PCR）和逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）的基础上,研发MDNV的一步法Taq Man实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测方法,以期为MDNV的快速以及定量检测提供新的技术支持,同时通过人工感染实验对MDNV的致病性进行了初步分析,并采用已建立的分子生物学、组织学等方法对近年我国养殖虾类中MDNV的流行情况进行了检测分析。首先,本研究在流行病学调查中,从山东寿光某一凡纳滨对虾养殖场采集了患病凡纳滨对虾样品,对该批次样品进行了RT-n PCR检测、组织原位杂交和组织病理分析。RT-n PCR结果显示,该批次样品呈现MDNV阳性,样品中未检测到CMNV和其他常见虾类病原;组织病理和原位杂交分析结果表明,患病凡纳滨对虾的肝胰腺组织中部分肝胰腺小管呈现明显的病理变化,病变肝胰腺小管的上皮细胞出现坏死,坏死部位均可观测到MDNV RNA探针的阳性杂交信号。将患病对虾肝胰腺组织进行匀浆、密度梯度离心,对纯化后的病毒进行电镜观测,可观察到大量直径约30纳米的MDNV样病毒颗粒。上述研究结果表明,山东寿光此养殖场的养殖凡纳滨对虾感染了MDNV。其次,利用上述纯化的MDNV病毒对健康凡纳滨对虾进行了体内注射感染实验。MDNV注射组对虾个体出现了明显的发病症状,主要表现为肝胰腺颜色变浅,腹节体色不透亮,甲壳变软。患病个体的组织病理分析结果显示,肝胰腺组织中部分小管坏死,坏死主要表现为肝胰腺小管上皮细胞的崩解和溃散。利用MDNV探针对肝胰腺组织切片进行的原位杂交结果表明,肝胰腺中坏死的上皮细胞细胞质中出现了明显的MDNV探针杂交信号;MDNV感染所致的肝胰腺小管局部性坏死与CMNV感染所致的肝胰腺全局性坏死的情况不同,反映出MDNV致病力相较于CMNV可能有所减弱;不过由于感染实验中未得到可靠的累计死亡率数据,MDNV的致病力还有待更进一步研究。第三,基于MDNV的Rd Rp基因设计了寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的p MD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过反应体系和反应程序优化,建立了MDNV的一步法Taq Man RT-PCR检测方法。优化后的一步法反应液主要组份为:11μL一步法RT-PCR缓冲液,0.8μL酶混合物,0.3μM正向、0.3μM反向引物,0.4μM探针,1μL模板、5.2μL RNA-free H20（共计20μL）;优化后的一步法反应程序为:54.5℃15 min,95℃1 min;95℃10 s,60.3℃30 s（45cycles）。特异性实验分析,结果显示新建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×1010～1.4×101拷贝数/μL标准质粒浓度范围内起始模板浓度与反应循环数间呈现良好的线性关系;该方法最低可检测到5.5×101拷贝的RNA标准品或者1.4×101拷贝的p MD18-MDNV标准质粒;分析还显示该检测方法批内和批间Ct值的CV分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和较高的稳定性。本研究针对MDNV建立的Taq Man RT-PCR方法具有准确、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖过程中MDNV的定性、定量检测与监测提供技术支持。第四,采用RT-n PCR、Taq Man RT-PCR和组织原位杂交三种检测方法对2018年和2019年取自我国部分内陆和沿海省市多种养殖虾类中CMNV和MDNV的检测和流行情况进行综合分析。结果表明,养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾中均存在CMNV和MDNV阳性检出;其中我国山东、湖南、广西以及海南等省市养殖对虾中均存在MDNV的流行且呈现出从南到北流行率逐渐递减的趋势,而采集自山东、广西、江苏、浙江等省市的样品中有CMNV阳性检测;从总体上看,2018年上述省市养殖虾类中CMNV的检出率为20.7%。2019年上述省市养殖虾类中CMNV和MDNV的阳性检出率分别为22.6%、21.6%。上述流行病学数据的分析结果显示,CMNV在我国多地养殖对虾中普遍存在,VCMD的传播和危害仍不容忽视;与此同时,养殖虾类中MDNV患病率也较高,其危害值得进一步调查和高度关注。