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甾体药物是目前世界上第二大类药物,市场占有比例逐年增长,具有重要的市场前景。9α-羟基雄留-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,多用于合成高抗炎、抗敏性的糖皮质激素类药物。目前,9α-OH-AD的生产多采用微生物转化植物甾醇而得。虽然通过菌种筛选和诱变选育等方法能够提高9α-OH-AD的生成浓度,但是仍存在着底物的利用率不高、转化效率偏低的问题。究其原因是微生物降解植物甾醇的代谢途径不清晰,途径中关键酶作用及其功能不明确。因此,本研究以实验室保藏的一株能够转化植物留醇生成9α-OH-AD的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)LY-1为研究对象,通过全基因组测序,分析比较了植物甾醇代谢的相关基因,并结合差异转录水平分析方法,确定了与产物合成相关性较大的相关酶。继而采用代谢工程的手段,对甾醇代谢途径中与目的产物合成相关的多个关键酶基因进行增强表达,从而构建高效合成9α-OH-AD的基因工程菌株,并经转化工艺优化,进一步提高了工程菌的底物投料浓度和目的产物9α-OH-AD的得率。主要研究结果总结如下:(1)分枝杆菌LY-1植物甾醇代谢途径的解析。对分枝杆菌LY-1进行全基因组测序,通过基因的组装分析,获得了 53个重叠群。通过基因序列预测和功能注释表明:分枝杆菌的功能蛋白主要分布在[Q](次级代谢产物合成和代谢)、[C](能量生成和转运)和[K](转录)等功能类中。将分枝杆菌LY-1与国内外已报道的甾醇降解菌株Mycobαcterium tuberculosis H37Rv和M neoαurum VKM Ac-1817D 中甾醇代谢途径的基因簇进行比对,结果确定了包括Cho(胆固醇氧化酶)、HsdA/HsdB(β-羟酰基CoA脱氢酶),KshA(3-留酮-9α-羟基加氧酶),KshB(3-留酮-9α-羟基还原酶),KstD(3-留酮-A1-脱氢酶)和17β-Hsd(17β-羟基甾体脱氢酶/异构酶)等37个甾醇代谢相关的酶及其基因,明确了分枝杆菌LY-1合成9α-OH-AD的甾醇代谢途径曲线。(2)植物甾醇代谢途径关键酶的确定。在植物甾醇代谢途径解析的基础上,比较分析了有无添加大豆油的两个条件下分枝杆菌LY-1转化植物留醇的发酵过程。根据转化过程中菌体生长和产物合成之间的关联特征,分别选取转化前期(60 h)、中期(84 h)和后期(168 h)三个时间点的样品用于后续差异转录水平分析。采用qRT-PCR技术,分析比较了两种条件下37个留醇代谢相关酶基因的转录水平差异情况。结果表明代谢途径中的9个酶基因在转录水平差异较为明显,为甾醇代谢途径的关键酶。其中2个为降解途径关键酶KstD,其他7个为合成途径关键酶,包括Cho,FadE30,HsdB,KshA2,KshB,Hsd1 和 FadA5。(3)分枝杆菌LY-1的代谢工程改造。在野生型菌株分枝杆菌LY-1中,分别对7个合成途径关键酶Cho,FadE30,HsdB,KshA2,KshB,Hsd1和FadA5进行了单一增强表达。结果表明,7个增强表达重组菌转化植物甾醇产9α-OH-AD的能力均有一定程度的提高,其中增强表达重组菌LY-1-kshA2的产物得率最高。当底物植物甾醇的浓度为15 g.L-1,产物9α-OH-AD的摩尔得率可达40.8%。为了进一步提高重组菌9α-OH-AD的生成能力,在单基因增强表达的基础上,构建了 kshA2,kshB和hsdB三个基因的组合增强表达重组菌株LY-1-kshA2-kshB-hsdB。结果显示,重组菌LY-1-kshA2-kshB-hsdB目的产物9α-OH-AD得率提高到43.4%。(4)基因工程重组菌株的转化工艺优化。以构建的重组菌株LY-1-kshA2-kshB-hsdB为研究对象,在摇瓶中考察了培养基组分如碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等对菌株转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响。并采用统计学正交试验方法对培养基组分进行了优化,最终确定了重组菌LY-1-kshA2-kshB-hsdB的最适培养基配方:玉米浆30g·L-1、KN034.0 g·L-1、NaH2PO41.2g·L-1、FeSO40.075 g·L-1 及 CaC120.10g·L-1。在该工作基础上,对培养条件进行了优化,确定了工程菌株的最适条件:pH 8.0,接种量2%,温度30℃,转速120rpm。在以上最适的培养工艺条件下,底物植物甾醇的投料浓度由15 g·L-1提高至30 g·L-1,目的产物9α-OH-AD的得率稳定在41%左右。