论文部分内容阅读
近50年来，人们发现许多化学物具有潜在的干扰野生生物和人类正常内分泌功能的不良效应，这些化学物被称之为内分泌干扰化学物(EDCs)或环境内分泌干扰物(EEDs)。在这些化学物中，农药引起了众多学者的注意，因为在农业生产和家庭防治虫害时大量地使用农药，在中国，由于拟除虫菊酯类和有机磷类农药在环境中能够相对快速地降解，因而它们基本上替代了那些能够生物蓄积和具有生物放大效应的有机氯农药，是目前农业上应用最为广泛的农药。然而，有一些研究结果表明这些农药能够引起生殖功能障碍，因此，本研究利用体外原代培养的大鼠颗粒细胞(rGCs)作为染毒模型，选择了拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯(Fen)与有机磷类农药辛硫磷(Pho)作为这两类农药的代表，侧重于研究其单剂和混剂对类固醇激素合摘要南京医科人学博十学位论文成的影响。 第一部分辛硫磷与氛戊菊醋对体外培养‘Cs类固醉激素合成的影响 为了探讨Fen与Pho单剂对激素合成以及激素合成酶mRNA和蛋白表达的影响，我们采用无血清培养的:GCS作为模型。:GCs取自未成年SPrague一Dawley大鼠(20一25天龄)，细胞分离培养方法参见文献并稍作修改。细胞接种于培养板中后，Fen及Pho分别以不同的浓度(o，l，s，25，125和625林mol几)进行染毒，染毒时间为24h。根据不同的实验设计，在部分培养液中加入卵泡刺激素(FSH)500林 g/L、forskolin 10林mol几、22(R卜舟胆固醇(22R一HC)25林mol/L、蛋白激酶抑制剂(pKI)2林mol/L以及8一Bromo一eAMP 1 mmol/L。染毒结束后，收集培养上清冻存于一20℃备用，待测孕酮(P4)和1邓一雌二醇(EZ)浓度。细胞内cAMP采用无水乙醇法进行提取。另外的实验中细胞总RNA及蛋白质也分别进行抽提以进行Rl’- pCR(或为realtimePCR)以及Westem’ blot检测。主要实验结果如下: 1.Fen能明显降低基础状态下rGCsP;的产生，并呈现剂量-效应关系，在125四ol几和625娜of几达到显著性水平，在培养液中加入500雌几的FSH时，Fen对P;产生的抑制作用更为明显。无论FSH存在与否，Fen都能使培养液中E:水平有所增高。 2.Pho能够刺激基础状态下rGCsP;的产生，并呈现剂量-效应关系，但当培养液中含有500林昨的FSH时，Ph。的这种刺激作用转变为抑制作用。Pho对基拙状态下:GCsE:的分泌没有影响，企摘要南京医科人学博十学位论文但对FSH刺激的E:分泌有抑制效应。 3.在培养液中加入PKx、8一Br一cAMP和forskolin时Fen均可以降低rGCSP;的合成:但只有在forskolin刺激下Fen对E:的刺激分泌依然存在，加入PKI、8一Br一cAMP后这种刺激作用则无。 4.培养液中存在8一Br-cAMP和forskolin时Pho对:GeS P4的合成无明显影响，而在加入PKI后对P;产生的刺激作用有所减缓。Pho不能改变8一Br-cAMP刺激的E:分泌，但加入PKI后能增加培养液中E:的含量，在加入forskolin后能减少培养液中E:的含量。 5.在培养液中加入22R一HC时，与基础状态相比，Fen对P4合成的抑制作用更为显著，而Pho对P;合成的促进作用却有所减缓。 6.两种农药对基础状态下rGCs细胞内cAMP含量均没有显著影响，但在FSH刺激下均能显著减少细胞内cAMP含量。 7.在mRNA水平上，两种农药均能增加基础状态下类固醇激素合成急性调节蛋白(stAR)基因的表达，同时均能降低胆固醇侧链裂解酶(P45osee)的表达水平。Fen对芳香化酶(p45oarom)表达无影响，但Pho能增加该基因的表达水平。 当培养液中加入500林g/L的FSH时，两种农药对p45osee表达的抑制作用更为明显，同时两者均能升高P450arom的表达水平，Fen对stAR的表达无影响，而Pho能抑制其mRNA水平。 8.与对mRNA水平的影响相一致，两种农药均能抑制基础状态下P450scc的蛋白表达水平，且在加入FSH以后抑制作用更为明显;两者均能升高基础状态下stAR的蛋白表达水平，但加入FSH以后，Fen则对该蛋白表达无影响，而Pho则对其产生了抑制效应。摘要南京医科人学博十学位论文 上述结果表明Fen与Pho均能干扰原代培养rGCS的激素合成，其机制可能涉及到了细胞内cAMP一依赖的蛋白激酶信号通路;同时，一些激素合成酶及相关蛋白(P45osee、stAR和P45oarom)表达的改变可能也起了一定的作用。