诱导性多潜能分化干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell, iPS)是通过特定的转录因子将体细胞重编程为干细胞,从而使其获得不断自我更新、增殖及具有多向分化潜能。2006年8月,日本学者Yamanaka研究小组首次利用4种转录因子—Cct4, Sox2, c-Myc和K1f4将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPS细胞；2007年,Yamanaka和Thomson研究小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞。这之后,世界各国对iPS的研究及关注度呈爆炸式增长,且也取得了一些突破性进展,如利用转基因法制备的无病毒的iPS细胞,建立了疾病特异的人iPS细胞,从所获得的iPS细胞中移除先前导入的转录因子,利用小分子化合物高效获得iPS细胞等,此外还建立大鼠和猴等iPS细胞系。且iPS细胞不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等限制,这些都将使得iPS细胞应用于临床前进了-大步,iPS细胞研究和应用将有望成为21世纪最伟大的医学生物学成就之一肝移植可以显著降低肝衰竭患者病死率,但由于供肝严重短缺,事实上仅有不足1/3的患者接受了肝移植手术,而大多数患者在等待供肝的过程中死亡。基于此种前提下,国内外学者设计、构建了不同类型的人工肝系统,为肝衰竭患者肝细胞再生及肝功能恢复创造条件,从而降低患者死亡率。肝细胞是人工肝系统的核心材料,对肝功能衰竭患者的肝支持作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能,尽管细胞来源种类较多,但目前尚未有一种可以完全满足临床的需要。鉴于iPS细胞是一种类似胚胎干细胞(ES细胞)具有不断自我更新、不断增值和具有多向分化潜能的细胞,且又不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律限制等优点,本课题拟借助逆转录病毒载体法将Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc四种基因导入利用组织块培养法获得的慢性肝衰竭患者皮肤成纤维细胞,进而获得iPS细胞,以实现以下目标：(1)熟练掌握基于逆转录病毒载体法将Yamanaka四质粒导入成体细胞使其重编程为iPS细胞这项技术,以为下一步我课题组人工肝系统用于慢性肝衰竭患者治疗探寻种子细胞来源提供技术保障；(2)建立人iPS细胞系,为研究其生物学特性及其诱导过程中调控机制奠定基础；(3)为人工肝系统探寻新的种子细胞来源。具体包括以下三部分研究内容：一：CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备二：逆转录病毒制备及鉴定三：人iPS细胞建立及鉴定目的：借助逆转录病毒将携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因的Yamanaka质粒转染进入利用组织块培养法获得的慢性肝衰患者皮肤成纤维细胞,从而获得iPS细胞,以实现上述3个目标。方法：1.CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备孕13.5天CF-1小鼠颈椎脱臼处死,无菌取出胎鼠,用镊子无菌条件下去除胎鼠的头、四肢、内脏,仅保留躯干。用眼科剪无菌条件下将躯干剪碎并加入等体积混合的0.25%与0.05%胰酶10mL于37℃,5%C02,95%湿度培养箱中15分钟,期间每隔3.0-4.0分钟取出培养皿,用吸管轻轻吹打1.0分钟。加入等体积的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养基终止消化,并接种至10cm培养皿中(约每个培养皿接种一个胚胎),一般传代培养至第三代,经不同质量浓度(5,10,15,20mg/L)的丝裂霉素C处理不同的时间(1,1.5,2,2.5,3小时)制备饲养层,并观察其增殖情况及1×105/冻存管冻存。2.逆转录病毒生产及病毒滴度测定逆转录病毒包装用QIANGEN质粒中量提取试剂盒对由中国科学院广州生物医药与健康研究院提供的携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的Yamanaka质粒、EGFP质粒与病毒包装质粒扩增并经过严格测序无误后,依据核酸以氯化钙——DNA共沉淀物的形式出现时可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内的原理,按照以氯化钙介导的转染程序对293-T细胞进行逆转录病毒包装,一般包装48小时后收集病毒上清,经病毒滴度测定后于-80℃保存备用。逆转录病毒滴度测定用5μl病毒上清感染15万293-T细胞,48小时后用4%多聚甲醛固定,DAPI染色,荧光显微镜下计数EGFP阳性细胞和总细胞数,将其带入公式：病毒滴度(IU/ml)=EGFP阳性细胞数/总细胞数÷5×1.5×105×103。3.逆转录病毒载体法重编程慢性肝衰患者皮肤成纤维细胞为iPS细胞(1)取一定量的病毒上清于0.45μm滤器过滤后转染慢性肝衰患者皮肤成纤维细胞(在患者知情同意下,利用组织块培养法获得)。(2)病毒感染24小时后,将患者皮肤成纤维细胞消化并按照1×104/孔的6孔板中,6孔板预先接种好饲养层细胞,7天后按照10×104/10cm皿接种10cm培养皿中,人胚胎干细胞培养基持续培养至第10天,10天后开始换为iPS细胞条件培养基。(3)20天左右开始调取克隆,选择AP阳性细胞继续扩增培养。4.人iPS细胞建系及其生物学特性鉴定(1)光学显微镜下观察iPS细胞克隆形态并拍照保存；(2)利用细胞免疫荧光法检测人胚胎干细胞标志性抗原表达；(3)提取iPS细胞总RNA,进而RT-PCR检测人ES细胞标志性基因表达；(4)人iPS细胞核型分析；(5)悬浮培养观察拟胚体形成及体外分化；(6)iPS细胞接种至SCID小鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果：1.CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备孕13.5天胎鼠,0.15%的胰酶将其躯干消化为单个胚胎成纤维细胞,传代培养至第三代,采用10mg/L浓度的丝裂霉素C处理2.5小时后,饲养层细胞能够很好的维持iPS生长5-7天,并保持其未分化状态。这符合干细胞生长特性。2.逆转录病毒包装及病毒滴度测定携带Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因的逆转录病毒载体及EGFP质粒与逆转录病毒包装质粒利用钙转染的方法共转染进293-T细胞以生产病毒,48小时后EGFP转染对照组在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,提示转染成功,并收集病毒上清。按照上述病毒滴度测定方法,病毒滴度值均在1×106IU/ml以上,同时表明病毒可转染真核细胞。3.逆转录病毒载体法重编程慢性肝衰患者皮肤成纤维细胞为iPS细胞用携带Oct4、Sox2、c-Myc和K1f4基因的逆转录病毒载体及转染对照组EGPF质粒的病毒上清各2m1感染肝衰患者皮肤成纤维细胞,24小时后种植于饲养层细胞上,并换为人iPS细胞诱导专用培养基持续培养至第十天；48-72小时后,EGFP对照组在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光,表示转染成功,一般于转染后第三天,成纤维细胞形态可发生变化,第七天左右可见ES样克隆出现,第十天左右开始更换为iPS细胞条件培养基,第二十天左右挑取AP阳性克隆继续扩增培养。4.人iPS细胞建系及其生物学特性鉴定(1)一般在转染后第7天左右,成纤维细胞形态发生明显变化,有ES样克隆形成,第20左右可以挑取碱性磷酸酶(AP)阳性克隆继续培养；(2)2株人iPS细胞AP染色呈阳性,且具有典型的ES细胞样克隆形态；(3)2株人iPS细胞系表达ES细胞特有的标志性基因；(4)2株人iPS细胞系表达ES细胞特有的标志性抗原：SSAE-4, SSAE-1, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct4;(5)2株人iPS细胞核型分析未见异常；(6)2株人iPS细胞系具有体外分化形成囊性拟胚体的能力,并表达各胚层的标志性基因；(7)2株人iPS细胞系均能形成畸胎瘤。结论：1.制备CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.5天。丝裂霉素C抑制CF-1小鼠胚胎成纤维细胞增殖的最佳浓度及工作时间为10mg/L,2.5小时,成纤维细胞饲养层可以维持5-7天。诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10mg/L丝裂霉素C处理2.5小时后饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。2.利用钙转系统包装的病毒滴度值均在1×106IU/ml以上,最佳感染复数为2m1/6孔板·孔,且其可以感染真核细胞。3.运用Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc四种基因能够成功将慢性肝衰患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPS细胞。2株iPS细胞具有hES细胞的一些生物学特性,且在体外传代过程能保持此特性,说明已初步建立了慢性肝衰患者的iPS细胞。