外源基因导入受体细胞后,其表达会受到多种因素的影响。其中,外源基因整合于染色体上的位置,对其是否表达及表达量的高低起着决定性作用。若外源基因随机插入到受体基因组中,易受位置效应(Position Effect Variegation,PEV)的影响,造成表达不稳定。前期研究发现,通过在表达载体上添加某些染色体的特定序列或优化目的基因表达单元的结构,模拟染色体上的高转录活性区域,能够减小位置效应的影响。另外,筛选出处于转录活跃染色体区域的位点,将外源基因直接整合到这些位点上,也可以实现外源基因稳定高效表达。猪作为具有重要农业和医学研究价值的大动物,目前还鲜有关于外源基因定点整合的研究。从猪基因组中发掘和筛选适合外源基因表达的友好整合位点,在不影响猪自身生长发育的前提下,实现外源基因稳定高效的表达,将有利于转基因技术在猪中更广泛的应用。本研究首先利用已发表的猪全基因组基因表达数据,进行外源基因候选整合位点的筛选。将基因组分成500 kb的表达单元,寻找在各组织中均一高表达的、处于转录活跃染色体区域的表达单元。因为癌症相关基因的功能相对重要,本研究在排除含有癌症相关基因的表达单元后,对500 kb表达单元的基因表达平均值进行计算。为了尽可能地降低外源基因插入对内源基因表达的影响,将表达水平排在前三位的表达单元中所有的基因间隔区域作为候选区域。最终选择了两个不含有非编码RNA、核小体形成能力较小的基因间隔区域作为候选整合位点,命名为Pifs501和Pifs302,其分别位于 chr15:137957000-137958000 和 chr16:44288700-44289700。本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源重组,实现了外源绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因在Pifs501和Pifs302位点上的定点整合。在细胞水平上,Pifs501和Pifs302位点能够支持CMV、PGK和EF1α启动子分别启动的外源EGFP基因在IBRS-2细胞和中国实验用小型猪(Chinese Experimental Mini Pig,CEMP)成纤维细胞中持续并稳定的表达;通过对候选整合位点前后各300 kb之内所有基因的表达水平进行定量分析,发现外源EGFP基因在Pifs501位点上的插入并未对邻近600 kb内基因的表达造成显著干扰;对EGFP基因插入候选位点后,启动子DNA甲基化的水平进行检测,发现插入到Pifs501位点上的EGFP基因,其启动子呈现较低的DNA甲基化水平;染色体免疫共沉淀实验结果表明,在Pifs501位点上整合的EGFP基因具有较低的组蛋白H3K27me3修饰程度。以上结果表明Pifs501位点处于表观相对开放的染色体状态上。在Pifs501位点定点整合EGFP的转基因猪中,EGFP基因能够在个体囊胚期、胚胎期以及出生后等不同发育时期稳定表达;并能在不同组织中广泛表达,其中以心脏和胰腺中的表达量较高。同时,外源基因在各组织中的稳定表达,并未显著干扰各组织中Pifs501位点邻近600 kb内源基因的表达。鉴于Pifs501位点在细胞和个体水平上适合外源基因表达的友好性,本研究利用Pifs501位点建立了含有Cre重组酶识别位点loxP的Master细胞系。通过将表达Cre重组酶的载体和两端带有loxP序列的Follistatin基因的替换载体共转Master细胞系,成功将Follistatin基因高效定点整合到Pifs501位点上。Pifs501位点上Master细胞系的建立,将外源基因的定点整合从依赖同源重组转换成依靠Cre/loxP系统介导的重组反应,从而极大地提高了外源基因定点敲入特定基因位点的效率。综上所述,本研究利用基因表达数据建立了友好外源基因整合位点的筛选方法;筛选出一个处于表观开放染色质区域且具有外源基因表达友好性的整合位点Pifs501位点;并利用Pifs501位点建立了可以用于后续外源基因定点整合的Master细胞系。此项工作为猪基因组的精确编辑,提供了良好的方法和工具,将极大地提高外源基因在转基因猪中的整合和表达效率,对转基因技术在猪育种产业及疾病模型构建中的广泛应用具有重要意义。