HCV是慢性肝脏疾病主要病因之一，并与肝硬化、肝癌的发生密切相关。目前对HCV感染尚无预防疫苗，治疗手段的疗效欠佳。因此，针对预防和治疗HCV感染的研究非常必要。病毒与细胞表面受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节，是决定病毒的宿主特异性、组织嗜性及致病性的主要因素之一。近年来研究认为HCVE2糖蛋白能特异性的与人CD81结合，认为CD81可能就是HCV的受体。二者的特异性结合与介导HCV入侵细胞并建立感染有关，E2蛋白被认为是发展HCV疫苗的候选抗原之一。HCV与受体相互关系的研究有助于阐明HCV致病机制，为进一步探索受体介导HCV感染的机理和寻找有效预防和治疗HCV的手段提供新的思路。 HCV基因组为包含约9600个核苷酸的单股正链RNA，包膜蛋白E2为其编码的主要的结构蛋白。许多研究者证明，其基因组序列包含aa386～810区域，参与构成HCV病毒粒子的包膜，并有两个高变区(HVR1、HVR2)。目前一般认为E2为Ⅰ型跨膜糖蛋白，分别带有N-糖基化位点和C-疏水区序列，而上述羧端还包含了E2的跨膜区序列和下游紧邻蛋白的信号肽序列。由于膜的不稳定性，包膜蛋白在大肠杆菌中的表达常常会产生毒性蛋白。既往已有针对去除跨膜区的可溶性E2蛋白的真核表达的报道，但表达量较低。而基于包膜蛋白E2作为靶分子的HCV疫苗研究需要解决抗原检测和疫苗接种后的免疫反应评价的问题，首先要求得到大量高纯度的包膜蛋白抗原及其相应抗体或抗血清。由于表达毒性蛋白及无法精确到C-末端跨膜区等原因，目前还没有关于全长E2蛋白原核表达的研究报道。因此我们选择在大肠杆菌系统中进行HCVE2和人CD81的表达和相互作用的研究，期望能同时解决表达蛋白性质和量的问题。E2蛋白上有多个抗原表位，一些位于高变区，一些位于相对保守区。根据HCVE2蛋白序列的特点，我们将HCVE2蛋白全长分为三个片段(分别包含高变异区、相对保守区和跨膜区)，进一步全面了解HCV包膜蛋白的功能，证实原核表达的HCVE2蛋白与人CD81能否结合，确定与人CD81结合的HCVE2上的具体表位。 为探讨HCVE2蛋白与人CD81的相互作用，本研究进行了如下工作：1.包含C端跨膜区的HCVE2蛋白全长的原核表达我们用RT-PCR法从1份丙型肝炎患者血清中提取到HCVRNA，RT-PCR扩增出HCVE2蛋白全长的三个片段序列(aa371～563片段A，aa506～703片段B和aa679～819片段C)。将HCVE2区基因三片段的PCR产物分别经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-22b(+)上，将纯化后的分别含E2区三段基因的重组质粒进行序列测定及分析，将获得的HCVE2全长1347nt的基因序列和其编码的氨基酸序列与GenBank中报道的HCV多个已知分离株序列比较，发现与属1b亚型的上海株序列同源性较高。虽然HCVE2氨基酸序列的变化可致编码蛋白的二级结构发生变化，进而引起抗原性的改变，从而逃避机体的免疫。但我们仍然观察到，在HCVE2序列高度变异的区域中总能发现多处相对保守的部分，它们可能在保持包膜蛋白某些生物学功能的稳定性方面起着重要作用。 将E2阳性重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导表达出带有His标签的E2三片段蛋白，表达出的蛋白质经SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。结果提示表达蛋白具有稳定性、高效性、可溶性，Westernblot结果显示表达蛋白均具有较好的抗原性。在大肠杆菌中克服了包膜蛋白对细胞的毒性作用，获得了包含C端跨膜区的HCVE2蛋白全长的可溶性表达，C端带有的His标签有利于表达产物的纯化，高产量的表达蛋白足够进一步的研究，能被抗His-tag及抗HCVE2单克隆抗体和丙型肝炎病人抗血清有效识别证明了原核表达的E2蛋白可能具有天然E2蛋白特异性的及构象依赖性的抗原表位。 2.人CD81蛋白的原核表达和鉴定据GenBank公布的人CD81cDNA序列(编号：NM-004356)设计一对引物序列，从健康人外周血淋巴细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增出人CD81编码区基因并进行序列测定和分析。将人CD81编码区基因的PCR产物连接到原核表达载体pET-22b(+)上，序列分析证实构建了含708bp的人CD81编码区的阳性重组质粒。将阳性质粒转化BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导表达出不带有His标签的人CD81蛋白，表达出的蛋白质经SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。结果提示表达蛋白仍然具有稳定性、高效性、可溶性和抗原特异性等特征。 3.HCVE2蛋白与人CD81的相互关系将新鲜制备的E2蛋白三片段分别和人CD81蛋白作体外结合实验，利用Ni-NTA树脂将带有组氨酸标签的E2三片段蛋白纯化，而人CD81蛋白不带有组氨酸标签，如果分别单独过NI柱时，通过HIS-tag单克隆抗体检测E2三片段蛋白可以与柱结合进入最后的收集液中，而人CD81蛋白则不能结合而被洗脱，必须在HCVE2蛋白与人CD81蛋白有结合时才可以在收集液液中检测到CD81蛋白。CD81单克隆抗体检测结果显示含E2蛋白B片段的收集液中发现了人CD81蛋白。由此可见E2蛋白B片段可与人CD81结合。多种证据表明本研究中表达出能与病毒受体CD81结合的功能性的E2蛋白，具有自然状态下E2蛋白类似的识别抗His-tag和抗E2抗体的能力。同时，原核表达的E2蛋白的抗原性及其结合人CD81的特性也证明了它与自然状态下E2糖蛋白具有相似的构象特异性。因此，本研究在大肠杆菌中大量表达的特异性E2蛋白提示它可能具有抗原特异性和构象依赖性的抗原表位。作为E2疫苗候选物及评价免疫效果的靶抗原，在一定程度上可能替代哺乳动物细胞表达的E2糖蛋白。由于与人CD81结合的E2序列不位于E2高变区内，相对保守，可以此制备人CD81拮抗剂或用修饰过的抗人CD81单克隆抗体来阻断E2与宿主细胞的结合。从而为找出普遍适用的阻断HCV与CD81结合的方法提供了直接有效的途径。 综上所述，本实验采用原核表达方法成功获得三个含不同区段的HCVE2蛋白，同时在大肠杆菌中成功表达人CD81蛋白。研究证实包含相对保守区的E2蛋白(aa506～703片段B)可与人CD81蛋白结合。研究结果对于进一步寻找治疗和预防丙型肝炎的新途径具有较大理论意义及实用价值。