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研究背景糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)的并发症之一,是排除其他病因,仅以高血糖、胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症引起的,以心肌细胞代谢紊乱为特征的心肌病变,虽然临床和流行病学证据都支持这一概念,但是目前对DCM的治疗依然以对症治疗为主,尚无针对这一疾病的药物问世。因此,对DCM的发病机制的进一步研究,可以深化对DCM的认识,有助于寻找DCM的药物治疗靶点。Mibefradil是一种特异性的T型钙离子通道阻滞剂。T型钙通道是广泛存在于神经、肾脏、平滑肌、血管内皮、心脏等多个器官的一种电压门控钙通道,具有低电压、失活速度快、单通道等特点,是人体内唯一的低电压钙通道。T型钙离子通道主要有Cav3.1(α1G)、CaV3.2(α1H)、Cav3.3(α1I)三种亚型。在胚胎时期,心脏的T型钙通道大量表达,与心脏的生长发育相关。机体成年后,心室的T型钙通道表达几乎消失,而心房中存在少量T型钙通道,参与窦房结4期缓慢去极化。研究表明,在一些病理状态下,如高血压心脏病和心衰,T型钙通道可在心室中大量再表达,而对T型钙通道进行敲除或抑制,可以改善高血压引起的心肌肥大、降低猝死率。离体研究显示,心肌细胞的T型钙通道在25 mM葡萄糖浓度培养基环境下表达水平显著高于5 mM葡萄糖浓度的培养基,这表明高葡萄糖环境会引起心肌细胞T型钙通道的表达上调。这一现象,提示,糖尿病高血糖环境引起DCM,可能是由于T型钙通道表达上调引起下游信号通路活性改变而导致的。目的与方法第一部分实验:探究高糖模型模拟体内高血糖环境的最佳处理时间。首先培养H9c2大鼠心肌细胞,实验分为5组:对照组,高糖处理12 h组,高糖处理24 h组,高糖处理48 h组,高糖处理72 h组,分别用CCK-8法检测细胞生存率;检测心肌肥大水平心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积的改变。第二部分实验:根据第一部分实验结果确定高糖模型所需高糖处理的最佳时长。采用T型钙离子通道抑制剂mibefradil作为处理药物。实验分为四组:对照组,高糖+溶剂组(高糖组),高糖+mibefradil低剂量组(低剂量组),高糖+mibefradil高剂量组(高剂量组)。在倒置显微镜下观察细胞生长状态;CCK-8检测各组细胞生存率;检测心肌肥大水平(心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积);检测细胞自噬情况;检测心肌肥大信号通路和自噬信号通路活化水平。第三部分实验:通过药物干预H9c2大鼠心肌细胞在各组的自噬水平,观察mibefradil是否通过PI3K/Akt/m TOR信号通路改变自噬而改善心肌细胞肥大。实验分为5组,对照组,高糖+溶剂组(高糖组),高糖+mibefradil组(mibefradil组),高糖+mibefradil+MK2206预处理组(MK2206组),高糖+mibefradil+rapamycin预处理组(Rapamycin组)。在倒置显微镜下观察细胞生长状态;CCK-8检测各组细胞生存率;检测心肌肥大水平(心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积);检测细胞自噬情况。通过电镜观察细胞内线粒体肿胀和自噬小体数量情况。检测心肌肥大信号通路和自噬信号通路活化水平。结果1.与对照组相比,高葡萄糖浓度(30 mmol/L)培养基环境处理12 h、24 h后,细胞存活率没有显著改变(P>0.05)。而培养48 h和72 h后,细胞存活率均显著下降(P<0.05)。相比于对照组,高糖处理12 h、24 h、48 h和72 h的细胞组,细胞表面积均显著增加(P<0.05),心肌肥大相关基因(ANP、BNP和β-MHC)的mRNA表达水平在高糖处理48 h和72 h后显著上调(P<0.01),高糖处理12 h和24 h细胞组的肥大相关基因表达水平与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。2.mibefradil可显著降低高糖环境下H9c2心肌细胞心肌肥大基因ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达水平(P<0.05);同时,mibefradil以剂量依赖性方式缩小了高糖处理的H9c2心肌细胞表面积。与对照组相比,高糖环境的H9c2心肌细胞p62蛋白水平降低,自噬小体数量增加(P<0.05),而mibefradil显著升高了高糖环境的H9c2心肌细胞的p62蛋白表达量,减少了自噬小体的数量(P<0.05),抑制了自噬。高糖环境下,Calcineurin的蛋白表达量上调,提高了NFAT3在细胞核内的蛋白含量,而mibefradil对其具有显著的抑制作用(P<0.05)。同时高糖环境轻度激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路,对比对照组,PI3K、Akt和mTOR的总蛋白含量没有改变,但是磷酸化水平轻度升高。而相较于高糖组,mibefradil进一步地升高了PI3K、Akt和m TOR的磷酸化水平(P<0.05)。3.Akt抑制剂MK2206和mTOR抑制剂rapamycin逆转了mibefradil对于高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大的改善效果。我们通过MK2206和rapamycin诱导H9c2的自噬,进一步讨论T型钙通道抑制剂mibefradil是否通过影响自噬来改善H9c2的心肌细胞肥大。和前述的实验结果一样,相比于对照组,高糖组H9c2细胞的心肌肥大相关基因、心肌细胞表面积和自噬水平增加;而相比于高糖组,mibefradil组的心肌肥大相关基因水平、心肌细胞表面积和自噬水平减少。MK2206和rapamycin分别在用mibefradil处理细胞之前进行2 h的预处理。结果显示,相比于mibefradil组,MK2206组的心肌肥大相关基因表达水平有所升高,但是对心肌细胞表面积没有显著改变(P>0.05);而Rapamycin组的心肌肥大相关基因的表达水平和心肌细胞表面积,均要显著高于mibefradil组(P<0.05)。并且,我们通过透射电镜观察各组细胞的自噬小体,发现MK2206组和Rapamycin组的自噬小体数量均高于mibefradil组,而Rapamycin组又显著高于MK2206组。提示MK2206和rapamycin均成功诱导了H9c2心肌细胞的自噬,而rapamycin是更强的诱导剂。这些结果表明,mibefradil通过抑制自噬,对高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大具有改善作用,而通过自噬的诱导,mibefradil的改善作用减弱。结论1.高葡萄糖浓度(30 mmol/L)培养基可以诱导H9c2大鼠心肌细胞肥大。2.T型钙离子通道抑制剂mibefradil可以通过对T型钙离子通道的抑制作用,降低心肌细胞超量自噬,从而改善高糖诱导的心肌肥大。3.Akt抑制剂MK2206和mTOR抑制剂rapamycin可以逆转mibefradil对高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大。4.T型钙离子通道抑制剂mibefradil通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,抑制超量自噬改善高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大。