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强心甾(CTS)是一类重要的天然产物,因其对Na~+,K~+-ATPase(NKA)具有强烈的抑制活性,在临床上被用来治疗慢性心力衰竭(CHF)已经有超过200年的历史。但水溶性差、治疗窗口窄等缺点,严重限制了这类药物的临床应用。研究表明,对NKAα2亚型具有选择性的强心甾能够增强心肌收缩力,同时仅引起轻微的系统毒性,相比于传统的强心甾,可以作为更加安全的强心药物。构效关系显示强心甾C-3位的寡糖部分对其发挥α2亚型选择性抑制起着关键性的作用。然而,通过化学合成的方法合成强心甾C-3位的寡糖受到很多限制,例如:立体和区域选择性差、繁琐的功能基团的保护与去保护步骤等。同样,利用微生物糖基转移酶对强心甾进行糖基化也面临着区域选择性差的缺点,并且只能获得强心甾单糖基化产物和少量的二糖基化产物。因此,开发一种普遍适用的方法,用来合成C-3位带有不同糖链长度的强心苷,具有重要的研究价值。本论文围绕强心甾C-3位糖基化和糖链延长开展了如下工作。(1)为了实现强心甾C-3位单糖基化,通过转录组数据比对首次从长春花中获得甾体3-O-糖基转移酶UGT74AN3,解释了长春花的悬浮细胞能够糖基化蟾毒内酯的现象;从地衣芽孢杆菌中成功的克隆和表达获得一个环糊精糖基转移酶(CGTase),在其催化作用下实现了强心甾C-3位糖链的延长。(2)我们报道了一种高效的一锅法酶体系用于合成C-3位具有不同长度糖链的强心苷,该体系将UGT74AN3和CGTase偶联实现了对强心甾的一锅糖基化。通过对该体系中的反应参数进行优化,使得糖基化产物产率提高,转化率在75.2%-99.5%之间。(3)该体系在强心甾药物糖基化方面具有很广的应用前景,它对不同结构的强心甾展现出了极强的底物宽容性。通过该体系总共获得20个强心苷,其中16个强心苷为新化合物。(4)乙型强心甾沙蟾毒精及其糖基化产物(3/3a/3b/3c/3d/3e)和甲型强心甾洋地黄毒苷元及其糖基化产物(7/7a/7b/7c/7d/7e),对NKAα2亚型的选择性抑制测试结果显示:苷元无选择性,糖基化产物对NKAα2亚型的选择性均增强;乙型强心甾二糖基化产物3b对NKAα2亚型选择性为3.07;甲型强心甾三糖基化产物7c对NKAα2亚型选择性为5.04。(5)进一步挑选对NKAα2亚型选择性最高的7c,利用斑马鱼模型对其进行毒性分析,7c相比母体7和阳性药地高辛,对斑马鱼胚胎的毒性明显下降。本论文报道的一锅酶法为合成更安全的强心甾类先导化合物提供了强大的工具,同时也彰显了宽容性生物催化剂在药物开发中的重要作用。对NKAα2亚型的选择性抑制研究为寻找新型高效低毒的强心苷先导化合物提供了科学依据。