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第一部分迷走神经及乙酰胆碱受体激动剂-烟碱对胶原诱导性关节炎小鼠T辅助细胞分布的影响 目的:T辅助细胞(helper T cell，Th cell)在调控类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)炎症反应中起了非常关键的作用。胆碱能抗炎通路可抑制RA动物模型-胶原诱导性关节炎(collagen inducedarthritis，CIA)小鼠的关节炎症。本部分探讨迷走神经及乙酰胆碱受体激动剂-烟碱对CIA小鼠体内T辅助细胞亚群分布的影响。 方法:40只DBA/1小鼠随机分成4组:对照组:假手术+每天腹腔注射PBS一次;模型组:假手术+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型复制;迷走神经切断术组:迷走神经切断术+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型复制;烟碱处理组:假手术+每天腹腔注射烟碱一次+CIA模型复制。迷走神经切断术组在关节炎复制前4天切断小鼠左颈部迷走神经，假手术仅暴露并不切除左侧颈部迷走神经。烟碱组在关节炎复制的前4天每天腹腔注射烟碱(250μg/kg)。评估小鼠关节炎症指数及关节组织病理炎症程度。酶联免疫吸附方法检测小鼠外周血IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1、Th2及Th17细胞比例。Western-blot技术检测小鼠脾脏中Th1、Th2及Th17细胞对应的专一性转录因子T-bet、GATA3及RORγτ的表达水平。免疫组化法检测小鼠关节滑膜中RORγτ的表达情况。 结果:乙酰胆碱受体激动剂烟碱显著减轻CIA小鼠关节炎症。迷走神经切断组小鼠关节炎症较CIA组加重，但两组间差异无统计学意义。与CIA组比较，烟碱组外周血IL-17A水平降低，IL-4水平增高;烟碱组脾脏中CD4+IL-17A+T细胞比例降低，CD4+IL-4+T细胞比例升高;烟碱组脾脏中Th17细胞专一性转录因子RORγτ表达下调，Th2细胞专一性转录因子GATA3表达上调;烟碱组关节滑膜中RORγτ表达降低;烟碱组和CIA组外周血IFN-γ、脾脏CD4+IFN-γ+T细胞比例及T-bet表达差异无统计学意义。 结论:烟碱减轻CIA小鼠关节炎症;烟碱减少CIA小鼠外周血、脾脏及关节滑膜Th17细胞分布;增加外周血及脾脏中Th2细胞分布，但对外周血及脾脏中Th1细胞分布无影响。 第二部分乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th17细胞分化的影响及MEK-ERK1/2通路在其中的作用 目的:Th17细胞亚群的分布异常及其细胞效应与RA炎症发生发展密切相关，本部分探讨乙酰胆碱受体激动剂烟碱和GTS-21对RA患者Th17细胞分化的影响。 方法:分离RA患者外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，加入不同浓度烟碱及GTS-21培养，ELISA法检测培养上清中IL-17A水平;用磁珠分选法从RA患者外周血PBMCs中分离得到CD4+T细胞，在Th17极化培养体系中加入烟碱或GTS-21，或α7烟碱型乙酰胆碱(nicotinic acetylcholine，nAch)受体阻断剂α银环蛇毒预刺激后再加入烟碱或GTS-21处理，ELISA检测培养上清中IL-17A水平，流式细胞术检测Th17细胞比例，Western-blot法检测RORc表达;CD4+T细胞经Th17分化培养72小时后，予烟碱，或MEK1/2抑制剂U0126预刺激后再加烟碱处理，ELISA检测培养上清中IL-17A水平，Western-blot法检测ERK1/2表达。 结果:不同浓度烟碱及GTS-21均可降低RA PBMCs培养上清中IL-17A水平。烟碱及GTS-21可减少Th17细胞分化过程中CD3+CD8-IL-17A+T细胞比例，减少培养上清中IL-17A水平及胞内RORc的表达，而α银环蛇毒可逆转烟碱及GTS-21对Th17细胞分化的抑制作用。烟碱可促进Th17细胞内ERK1/2的磷酸化，而U0126可阻断烟碱对ERK1/2的磷酸化。 结论:烟碱及GTS-21通过作用于α7nAch受体抑制RA患者CD4+T细胞向Th17细胞分化，烟碱对Th17细胞分化的抑制作用与激活MEK1/2-ERK1/2信号通路有关。 第三部分乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th1、Th2细胞分化的影响 目的:在RA中，Th2细胞比例减少，Th1细胞比例增多，Th1/Th2比例失衡促进了RA关节炎症的发生发展。本部分探讨乙酰胆碱受体激动剂烟碱和GTS-21对RA患者Th1和Th2细胞分化的影响。 方法:分离RA患者外周血PBMCs，加入不同浓度烟碱及GTS-21培养，ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4水平;用磁珠分选法从RA患者外周血PBMCs中分离得到CD4+T细胞，分别在Th1、Th2分化培养体系中加入烟碱或GTS-21，或乙酰胆碱受体阻断剂α银环蛇毒预刺激后再加入烟碱或GTS-21处理，ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4水平，流式细胞术检测Th1和Th2细胞比例，Western-blot法检测T-bet和GATA3表达。 结果:GTS-21可降低RA PBMCs培养上清中IFN-γ水平。GTS-21可减少Th1细胞分化过程中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞比例，减少培养上清中IFN-γ水平及胞内T-bet的表达，银环蛇毒可逆转GTS-21对Th1细胞分化的抑制作用。但烟碱对CD3+CD8-IFN-γ+T细胞比例、培养上清中IFN-γ水平及胞内T-bet表达无影响。烟碱和GTS-21可提高PBMCs培养上清中IL-4水平，烟碱及GTS-21可增加Th2细胞分化过程中CD3+CD8-IL-4+T细胞比例、增加培养上清中IL-4水平及胞内GATA3的表达，而银环蛇毒可逆转GTS-21对Th2细胞分化的促进作用。 结论:GTS-21通过作用于α7nAch受体抑制RA患者CD4+T细胞向Th1细胞分化，烟碱对Th1细胞分化无影响;烟碱和GTS-21通过作用于α7nAch受体促进RA患者CD4+T细胞向Th2细胞分化。