第一部分rhGH改善POI大鼠卵母细胞质量及机制研究目的:早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）是指女性在40岁前因卵母细胞过度激活与耗竭导致卵巢功能减退,平均发病年龄约23岁。POI的发病率约为1-3%,自然妊娠率仅为5-10%。患者常表现为原发或继发性闭经、不孕并伴有高促性腺激素和低雌激素血症。其病因复杂多变,包括遗传因素、免疫因素、医源性因素、环境因素等。目前,POI是不可逆转的,临床上缺乏有效的干预手段并且疗效有限。因此迫切需要寻找积极的干预措施来改善POI患者卵母细胞质量,以提高患者生育力。方法:本研究利用环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）腹腔注射构建POI大鼠模型。造模后,分别给予低、中、高剂量聚乙二醇化人重组生长激素（Recombinant human PEGylated growth hormone,rhGH）。干预期间,动态记录各组大鼠动情周期变化。干预结束后,利用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测外周血中性激素水平、分析比较大鼠卵巢组织中不同时期卵泡的数量、氧化呼吸链关键基因的mRNA水平及卵巢组织细胞的凋亡变化表达。为了进一步评估卵母细胞质量,对大鼠进行超数排卵后获得卵母细胞。分别检测各组大鼠卵母细胞内线粒体膜电位、活性氧化产物水平、ATP含量、线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数。同时,借助透射电镜技术分析并评估各组大鼠卵母细胞线粒体的超微结构特征与变化。结果:CTX会严重破坏卵巢功能,导致动情周期发生紊乱及卵泡的过度耗竭,引起初级或次级卵泡减少。相较于正常组,POI模型大鼠卵巢指数及卵巢重量均显著降低、促卵泡素（Follicle-stimulating hormone,FSH）升高（P＜0.01）及雌二醇（Estradiol,E2）水平降低（P＜0.05）。与此同时,CTX造模后大鼠卵巢组织细胞中凋亡的阳性细胞数量显著增多（主要是颗粒细胞）;氧化呼吸链关键调控基因Sdha的表达显著下调（P＜0.05）。rhGH干预治疗后,卵巢功能得到一定程度的改善,体现在中、高剂量rhGH干预后卵巢重量增加;相较于模型组,高剂量rhGH干预组大鼠卵巢中次级卵母细胞数量增加,动情周期持续记录下间情期比例减少,动情周期节律部分恢复;中、高剂量rhGH可明显减少标记阳性细胞数,即凋亡细胞数（P＜0.01）。在卵母细胞质量评估方面,与CTX模型组相比,中、高剂量rhGH组均能显著降低氧化产物含量并提高卵母细胞内ATP含量;高剂量rhGH干预后卵母细胞线粒体膜电位差异有显著性改变（P＜0.05）。通过对线粒体DNA拷贝数的绝对定量分析后,结果表明卵母细胞mtDNA拷贝数组内异质性较大,各组间差异不显著。与正常组相比,模型组卵母细胞的线粒体肿胀程度增大,基质中的电子密度较低。中、高剂量rhGH干预后卵母细胞的线粒体形态发生了明显的变化,基质更加均匀,电子密度增加。结论:CTX的细胞毒性作用会严重破坏卵巢功能及卵巢内环境的稳定,从而导致卵母细胞质量的下降。rhGH是POI生育力保护的潜在干预措施,主要通过调节卵巢微环境、减少颗粒细胞凋亡和氧化应激损伤来发挥作用,直接或间接改善卵母细胞的能量代谢及氧化-抗氧化损伤系统平衡来提高卵母细胞质量,从而调节卵母细胞的发育与成熟。不同剂量的rhGH所产生的改善效应不尽相同;其中,高剂量rhGH是POI的适宜干预浓度。第二部分rhGH干预下卵母细胞调控网络及核心基因筛选目的:通过第一部分的研究,初步明确了 rhGH在POI疾病模型中对卵母细胞质量的改善作用。在此基础上,拟进一步探索CTX和rhGH干预后卵母细胞内信号通路的变化,筛选并鉴定出影响卵母细胞质量的关键基因和调控网络,从而更好地理解CTX和rhGH产生药物效应的作用机制,为未来的转化应用提供充分的科学理论依据。方法:为了确定各组卵母细胞中关键基因的差异表达与变化,大鼠进行促排卵后分离各组卵母细胞,并进一步利用单细胞全长转录组测序技术（Single cell full-length mRNA sequencing,scRNA-seq）对卵母细胞进行全长基因扩增、文库构建及测序分析。原始数据经过滤质控、参考序列比对分析后获得各样本基因表达量。基于筛选标准（P＜0.05,FC＞1.5）明确CTX及rhGH干预后的差异表达基因,对差异基因进行功能注释后分类探讨这些差异基因所参与的生物学功能;同时,整合Lasso回归和广义线性回归分析方法构建模型,以进一步筛选出CTX及rhGH干预下影响POI疾病发生及卵母细胞质量的核心调控基因。结果:与正常对照组相比,CTX造模后有44个基因下调,34个基因上调。与此同时,与POI模型组相比,rhGH干预后217个基因表达上调,58个基因表达下调。在GO富集分析方面,Mo组与Wt组的差异基因主要富集到能量代谢及信号转导的调节过程,如细胞对钙离子的反应、MAPK级联信号（Biological process）;呼吸链复合体Ⅳ、呼吸链、线粒体（Cellular component）;细胞色素-c氧化酶活性、NOTCH信号、信号转导活性（Molecular function）。通过KEGG富集分析发现,这些差异基因主要富集于氧化磷酸化、MAPK级联信号及代谢途径。rhGH干预组与POI模型组的差异基因主要参与了细胞氧化解毒和对多肽激素的反应（Biological process）。此外,线粒体是这些差异基因的所富集的细胞成分基因。在分子功能类别中,谷胱甘肽过氧化物酶活性和胰岛素样生长因子结合发挥了关键作用。KEGG通路富集分析发现rhGH干预后谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化途径是重要的调控途径。为了识别CTX造模后影响卵母细胞质量的核心调控基因,综合Lasso回归和广义线性回归分析的结果并最终筛选出4个核心基因,即Tem232,RGD1308750,Sdf2l1和Pxmp4。如Forest plot结果显示,Sdf2l1和Pxmp4可能是POI疾病潜在的保护因素（OR=0.90[0.83,0.96],0.72[0.69,0.75],P＜0.01）。RGD1308750（OR=1.22[1.07,1.38],P＜0.01）则可能是促进疾病发生与进展的危险因素。类似地,通过比较rhGH干预组与模型组的差异基因,利用Lasso回归和广义线性回归分析最终筛选出14个基因。其中,5个基因（AABR07045485.1、Ehbp1、Pxmp4、S100B和Abhd14b）在高剂量rhGH干预后上调,9 个基因（Pacsin1、CD180、LOC103690137、Dcbld2、Enpp6、Mrps10、MT-cyb、Gda和AABR07046731.1）表达下调。其中,共有6个基因在对于rhGH的改善效应有负向调节作用,包括Cd180,Gda,Mrps10,Pacsin1,Dcbld2及AABR07046731.1（OR=0.95[0.91,0.98],0.93[0.87,1.00],0.89[0.83,0.95],0.92[0.89,0.96],0.94[0.88,1.00],0.93[0.88,0.97]）;相反,仅有 Pxmp4发挥了潜在的促修复作用（OR=1.27[1.21,1.34],P＜0.01）。结论:通过上述研究探究卵母细胞基因表达模式的变化,再次验证到了 CTX及rhGH体内干预后的基因调控网络变化。即这两者是通过调控线粒体氧化呼吸及能量代谢平衡、调控卵母细胞氧化解毒能力来影响POI卵母细胞质量的。同时,基于综合的生物信息学分析,最终明确的这些核心调控基因未来有望作为POI疾病卵母细胞质量改善的新靶点。第三部分rhGH干预下肠道菌群-代谢重塑及卵巢指标相关性分析目的:机体氧化应激平衡依赖于肠道菌群与宿主之间共生关系的稳定;相反,肠道菌群结构及代谢紊乱将导致氧化活性产物的过度蓄积、加剧组织氧化损伤。因此,深入探讨POI与肠道菌群的潜在关系,将有助于了解其发病机制并进一步发掘POI患者生育力保护的新靶点。在调控肠道菌群方面,生长激素在肠粘膜屏障的保护、菌群肠道移位、菌群稳态失调的干预中有重要意义。生长激素可以促进IGF-1的产生,增加DNA或蛋白质的合成,促进隐窝细胞的转化。因此,在本部分的研究中拟探讨rhGH在POI疾病中肠道菌群-代谢重塑方面的作用,并进一步揭示后者与POI疾病卵巢功能的潜在联系。方法:基于前两部分的研究,本部分研究从肠道粘膜屏障、肠道菌群-代谢重塑方面来探索CTX及高剂量rhGH干预后的相应变化。通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin,HE）检测各组大鼠肠道组织病理变化,利用阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色（Alcian blue periodic acid schiff staining,AB-PAS）评估肠粘膜杯状细胞分布,通过TUNEL实验检测各组组织的凋亡状况,并基于FITC-dextran荧光渗漏实验及肠粘膜屏障相关蛋白ZO-1的表达来分析各组的肠粘膜完整性。为了评估各组大鼠机体及肠道的氧化-抗氧化平衡系统,本研究测验了血清及肠道组织中抗氧化性指标或酶的活性,包括T-AOC、CAT活性、SOD、GSH-PX和MDA。此外,借助MSD多因子检测技术评估了炎症反应指标。在此基础上,通过16S微生物组测序分析了各组大鼠粪便的群落结构特征及优势菌群。与此同时,利用液相色谱串联质谱（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）筛选 CTX 及 rhGH 干预后肠道粪便代谢谱的变化。结合多组学检测结果及生物信息学分析,进一步筛选核心菌群相关的代谢产物,并评估其与卵巢指标的潜在相关性。结果:肠道组织病理分析结果表明CTX造模后肠粘膜上皮细胞连续性不完整,腺体遭到破坏。相反,rhGH干预后能够有效地缓解这种损伤。POI模型组大鼠肠粘膜上皮绒毛高度、隐窝深度及杯状细胞数量低于正常对照组,而rhGH干预组在一定程度上改善了这种情况。此外,CTX可导致引起FITC-dextran在血清中浓度升高（P＜0.01）,而rhGH干预能减少渗漏。同时,CTX可抑制肠道组织ZO-1的表达,而rhGH干预可上调其表达（P＜0.05）。TUNEL实验提示各组间凋亡细胞数量的差异不是很显著。在氧化应激相关的非酶活性和酶活性指标方面,CTX会抑制大鼠血清或肠道组织中CAT的活性;反之,rhGH干预后其活性增强。此外,CTX还能抑制肠道组织中GSH-PX的活性及SOD的活性,而对MDA含量无明显影响。值得注意的是,POI模型组和正常组大鼠的血清和肠道组织中T-AOC的差异均是显著的。MSD多因子检测结果表明CTX造模或rhGH干预后只有少数细胞因子发生了改变。rhGH干预组大鼠肠道组织中IL-4含量明显升高（P＜0.05）。此外,CTX组大鼠肠道组织中KC/GRO水平明显高于正常对照组（P＜0.05）。基于粪便标本的16S微生物组测序,发现正常组和rhGH干预组在群落结构变化中表现出类似的趋势,这两组物种丰度指数ACE和Chaol均小于模型组（P＜0.01）,CTX造模后的大鼠肠道微生物Shannon指数的降低也明显高其它两组。在物种多样性的相似程度方面,3组样本组内相似度较高,组间物种多样性存在一定差异。根据筛选标准进一步确定了各组特征性的菌群标志物,模型组中的代表性的肠道菌群类型为Oscillospiraceae和Lactobacillusjohnsonii。而rhGH干预组中标志性的菌群类型包括Lactobacillales及Lactobacillus murinus等。通过肠道粪便代谢产物质谱检测,观察到CTX造模后51种代谢物含量增加,20种代谢物表达下调。此外,rhGH干预后大多数差异代谢物均是下调的,仅有18种代谢物含量增加。KEGG数据库注释结果显示与正常组相比,CTX造模后的差异代谢物主要富集于mTOR信号通路和细胞凋亡通路等。rhGH干预后的主要围绕于类固醇激素生物合成及甘油磷脂代谢等生物学功能。为了鉴定到与肠道微生物群落变化相关的核心差异代谢物,利用相关性分析及对应分析最终筛选到1个核心代谢物,即3-Aminobutanoic acid。类似地,在rhGH干预组及CTX模型组进行比较时,用同样的方法明确了 2种核心代谢物,N6-乙酰-L-赖氨酸和3-Aminobutanoic acid。3-Aminobutanoic acid 的含量与总卵泡数呈负相关关系（r=-0.38,P＜0.05）。但是,它的含量与卵巢重量并无明确相关性。此外,在分析3-Aminobutanoic acid和卵巢指数之间的相关时,这两者之间也存在负相关关系,但无明确的统计学意义。N6-乙酰-L-赖氨酸含量与上述卵巢指标均并未见明确的统计学上的相关性。结论:CTX造模后肠道粘膜屏障完整性遭到破坏,rhGH干预在一定程度上能够缓解CTX对肠粘膜组织的细胞毒性作用,提高机体和组织中抗氧化能力。此外,CTX会直接影响肠道微生物变化,表现在物种多样性及丰度的升高,而rhGH干预后所引起的菌群结构变化主要参与调节生物代谢过程。经综合的生物信息学分析,最终筛选到CTX及rhGH干预后与菌群变化关系密切的两种代谢产物,其中3-Aminobutanoic acid与卵巢的一些功能参数存在相关关系。