目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是人类疱疹病毒组中最大的双链DNA病毒,感染较广泛,但是通常在健康群体中不发病,呈亚临床状态。然而,对于免疫低下或缺陷的群体,比如孕妇、儿童、移植受体或艾滋病患者,它会导致机体出现严重的并发症,甚至死亡。HCMV至今仍被认为是导致新生儿先天及围产期感染最重要的病毒之一,儿童尤其是6个月以下的婴儿和早产儿,由于其免疫力较低,极易罹患HCMV的感染,主要表现为不同程度的多器官组织的损伤尤其是对肝功能的损伤,此外神经系统、呼吸、血液及泌尿等系统都会出现不同程度的感染和损伤。HCMV感染机体后所诱导的免疫逃逸机制及致病机制十分复杂。而具有重要的基因调节作用的microRNA（miRNA）在HCMV感染过程中发挥了重要作用,在基因表达的转录后水平发挥作用,通过完全或不完全结合介导靶分子mRNA的降解或抑制其翻译,进一步调控基因的表达。细胞或病毒编码的miRNAs可以选择性地包装入外泌体等囊泡,广泛存在于人的多种体液,包括尿液、唾液、血液、乳汁、羊水、脑脊液等,并且不被相关核酸酶所降解,从而在机体局部或全身循环发挥细胞间信息交流等重要的生理功能。作为介导细胞间物质和信息交流的载体,外泌体属于胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）的一种,根据结构直径的大小,胞外囊泡可以分为3种亚型:凋亡小体（apoptotic bodies）、微泡（microvesicles）和外泌体（exosome）。越来越多的证据表明,胞外囊泡特别是外泌体对细胞间通讯传递信息起着重要的作用,从而影响到各种生理和病理过程。多种类型的细胞均可分泌外泌体。外泌体中不仅含有蛋白质、脂质,而且含有大量的mRNA、miRNA和其它非编码RNA,释放到细胞外环境中的外泌体可吸附于细胞的包膜上,通过融合或者是内吞作用进入胞内,释放包裹的物质,触发这些受体细胞不同的特定反应。根据miRBase数据库最新数据显示在HCMV中已发现15种miRNA前体,编码26种成熟的miRNA,其编码区分散存在于HCMV的基因组中。HCMV编码的miRNA不仅调节自身基因的表达,还可以在感染过程中调节宿主基因的表达,从而创造出适合于病毒感染和复制的微环境。鉴于外泌体在病毒感染过程可能发挥重要的生物学功能,我们有必要了解在HCMV感染复制的过程中,感染细胞分泌的外泌体所含的病毒miRNA种类及分布情况。在本研究中,首先通过高通量测序对HELF以及HCMV感染HELF后其上清外泌体的miRNA的表达谱进行分析,筛选出差异表达的HCMV miRNA,通过TaqMan方法对HCMV miRNA进行检测验证,最后分析其在HCMV患者外周血中的含量及在临床中的意义。方法:1、从HCMV Han BAC感染细胞培养上清物和感染患者的外周血清中分离出外泌体:利用exoEasy Maxi Kit（QIAGEN）用于分离、纯化HCMV感染HELF细胞和患儿外周血清中的外泌体,采用透射电镜和通过western blot检测外泌体蛋白标志物TSG101的方法进行外泌体鉴定。鉴定经试剂盒分离纯化的外泌体是否混有HCMV病毒颗粒,将感染HCMV Han BAC的外泌体与HELF细胞孵育后,荧光显微镜观察是否有GFP的表达。2、外泌体miRNA的提取:利用miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）提取细胞内的总RNA,利用exoRNeasy Maxi Kit（QIAGEN）提取外泌体的总RNA,Nanodrop 1000分光光度计测量RNA的浓度及纯度。3、文库的构建及测序:取HELF细胞及Han BAC感染HELF后分泌的外泌体总RNA各2ug用于构建小RNA文库。方法如下:对纯化后的总RNA进行3’端接头及5’端接头的连接,反转录及扩增,cDNA文库的纯化及质检,完成测序样本文库构建。使用Qubit?2.0 Fluorometer检测浓度,Agilent 2100生物分析仪检测文库的大小。测序采用lllumina公司的Hiseq 2500。根据以下原则对两组间有显著差异表达的miRNA进行筛选:1)绝对reads数大于10;2)miRNA表达的差异倍数即log₂^HAN1/HELF大于2或者小于0.5;3)P值小于0.05。4、TaqMan茎环探针法:检测hcmv-miR-US25-1-5p（MIMAT0001581,ABI）和hcmv-miR-UL112-3p（MIMAT0001577,ABI）的相对定量,计算三个复孔的平均值作为每个样本的实际CT值,以U6为内参基因,采用相对定量方法(2^-△△CT)对结果进行比较、分析。5、HCMV感染患者血清标本收集:HCMV患者均为中国医科大学附属盛京医院住院患者,诊断标准符合2012年中华医学会儿科学分会感染学组修订的诊断标准,选择年龄小于6个月以下,通过常规化学发光法检测血清抗HCMV-IgM阳性,实时荧光定量聚合酶链反应（QRT-PCR）法检测尿液中HCMV的DNA拷贝量≥10³/ml。所有患儿的血清标本系本院常规临床生化检查后的废弃标本,取血清1-4ml。有关研究已获得盛京医院伦理委员会批准,同意免除知情同意书签署的申请。6、使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5等统计学软件对所得结果进行数据统计,当P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果:1、从HCMV Han BAC感染的HELF细胞中提取到的外泌体,通过透射电镜的结果显示,符合文献所报道的特征;并且用Western blot检测到外泌体蛋白标记物TSG101。感染HCMV Han BAC的外泌体与HELF细胞孵育后,在绿色荧光激发条件下始终未见GFP荧光信号,说明实验中分离纯化的HCMV感染细胞外泌体样本中没有HCMV病毒颗粒的污染。2、通过IIIumina公司的Hiseq 2500测序技术对HELF细胞及其Han BAC感染后的HELF细胞分泌的外泌体中小RNA文库进行测序,各获得干净序列的总read数分别为33074443和27976426;与HELF细胞外泌体比较,Han BAC感染细胞外泌体中共有58种宿主miRNA含量显著性升高,其中有32种是Han BAC感染细胞外泌体特异性miRNA,hsa-miR-182-5p含量增高倍数最高,上调857.42倍,其次是hsa-miR-4634和hsa-miR-3651,分别为367.46和102.77倍;在Han BAC感染细胞外泌体中含量显著性下降的宿主miRNA共有70种,其中有22种miRNA是在非感染HELF外泌体中特异性检测到的,下降倍数最高的分别是hsa-miR-561-5p（180倍）,hsa-miR-598-3p（128倍）和hsa-miR-589-5p（128倍）。此外,在感染细胞外泌体中发现了16种HCMV编码的成熟miRNA,其中含量最高的是miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p。3、收集HCMV HAN BAC株感染HELF后的0、6、24、48、72及96小时外泌体及细胞的总RNA,通过TaqMan PCR技术检测HCMV miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p的相对含量,结果显示均在感染后的6小时即可在外泌体及细胞中检测到两种HCMV miRNA,且随着复制周期时间的延长,含量逐渐增加;对这两者在细胞和外泌体的含量做相关性统计学分析,发现HCMV的miRNA在感染后的不同时间中外泌体的含量与在相应细胞内的含量成正相关;但是通过western blot检测外泌体蛋白标志物TSG101,发现在相应时间点的外泌体的浓度和数量并没有随着HCMV复制周期的延长而增加。4、提取感染HCMV 72小时后的外泌体和正常HELF细胞共培养,通过TaqMan发现2小时后即可在细胞内检测到HCMV miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p,并且随着共培养时间的延长,两种miRNA在细胞中的含量逐渐增高。5、72例HCMV（+）患儿外周血清,22例HCMV（-）的健康患儿血清为对照组同时进行扩增。在72例HCMV（+）患儿外周血清提取的外泌体中有64例检测出miR-US25-1-5p阳性,8例阴性;60例miR-UL112-3p的阳性,12例阴性（P<0.05）;其中两者均为阴性的共5例。统计分析发现hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p不仅与尿中HCMV病毒颗粒的拷贝量成正相关,并且hcmv-miR-US25-1-5p相对含量和胆汁淤积生化指标成正相关（P<0.05）。结论:1、HCMV感染改变了HELF细胞分泌的外泌体中宿主miRNA的种类和含量。2、HCMV感染HELF细胞的外泌体中含有16种HCMV编码的成熟miRNA,其中含量最高的是hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p。3、HCMV miRNA在感染细胞外泌体中含量的升高是与感染细胞中病毒miRNA转录量的升高密切相关的,似乎外泌体对病毒核酸的包装不具有显著富集作用。4、HCMV感染可使病毒miRNA包装入细胞外泌体中且经外泌体在细胞间转运。5、hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p在感染患者外周血清的外泌体中高比例存在,并且含量与病毒复制水平显著正相关。6、hcmv-miR-US25-1-5p和胆汁淤积生化指标γ-谷氨酰基转肽酶、结合胆红素及胆汁酸水平显著正相关。