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本实验研究了不同种植密度下地黄的农艺性状、产量与品质形成规律,并进一步分析稀植、密植(高、中、低三种密度)对地黄生长发育过程中叶片的生理指标、植株形态特征、生物量和有效成分含量变化规律的影响,应用转录组测序技术初步分析了不同密度对地黄生长发育和品质形成的分子调控机制,并对地黄环烯醚萜合酶基因进行了克隆和遗传转化。主要研究内容如下:1.研究种植密度分别为 8000 株·667m-2、15000 株·667m-2、22000 株·667m-2、30000 株·667m-2和38000株·667m-2时,地黄优良品种85-5和北京3号(BJ3)植株不同发育阶段地上部和地下部的农艺性状、生物量、有效成分积累变化规律。结果表明,从出苗到到收获,2个品种的叶长度、叶宽度、叶片数、冠幅、株高、叶绿素含量SPAD的变化趋势均为先升高后下降,叶长度、叶宽度和叶片数最大值都是8月份,冠幅和株高最大值是在9月份;叶片的生物量先升高后下降,最大值都在8月份,85-5叶的叶片生物量较BJ3大;块根长度、块根直径和块根数随着植株的生长,总体为增大趋势:2个品种的叶长度、叶宽度、叶片数、冠幅和叶绿素含量SPAD都随密度增大而减小,株高随密度增大先增大后减小;同一发育阶段,叶片生物量随密度增大而减小;块根长度、块根直径和块根数随密度增大而减小,85-5的根长度和块根直径较大,BJ3块根数较多;密度越低,单株块根的生物量越大,85-5的块根生物量变化趋势更明显,BJ3生育后期密度间块根生物量差异不显著。随着地黄块根的发育,梓醇含量逐渐增加,不同密度间也有差异,密度为22000株·667m-2时块根中梓醇含量最高,85-5的块根梓醇含量高于BJ3。块根中毛蕊花糖苷含量在地黄生育期内呈波动变化,85-5毛蕊花糖苷含量最大值在10月份,BJ3在11月份。地黄理论产量在11月份最大,亩产量随密度增大而增大,85-5亩产量在密度22000株·667m2与30000株·667m-2相差较小,BJ3密度间差异较为显著。单纯纯考虑产量,85-5和BJ3 2个品种均应在高密度下种植。2.研究种植密度分别为5000株·667m2、25000株·667m-2和50000株·667m-2下85-5、BJ3、J9的生理指标、农艺性状、产量和品质的变化。结果表明,不同发育阶段,3个品种叶片中生理指标变化趋势大致相同。地黄叶片叶绿素含量先升高后下降,8月份叶绿素含量最大,低密度下叶绿素含量较高:地黄叶片中SOD活性随生育期逐渐升高,POD活性随生育期逐渐下降,高密度下二者的活性较高;CAT活性变化趋势为先下降后上升,最大值在1 1月份;MDA含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量变化趋势均为先上升后下降,其含量最高时期分别为8月份和9月份,MDA和可溶性糖高密度下含量较高,可溶性蛋白低密度下含量较高。不同发育阶段,地黄叶长度、叶宽度和株高总体呈先上升后下降趋势,8、9月份的值较大;叶片数和冠幅呈增大趋势;密度越大,叶长度、叶宽度、叶片数越小,而株高越大;单株叶片生物量9月份较大,密度越低生物量越大。随植株的生长,3个品种的茎长度、茎直径、茎生物量值不断增大,3个时期低密度下85-5的茎长度均大于高密度,生育后期J9的茎长度较大;茎直径和茎生物量均为密度越小其值越大。地黄块根长度、块根直径、块根数和单株块根生物量均随着地黄植株的生长逐渐增加,低密度处理大于高密度。3个时期产量均为密度越大产量越高。不同的生育期地黄指标性成分的含量也有变化,9月份叶中梓醇和毛蕊花糖苷含量较高,且密度越大含量越高,其它时期含量变化规律性不强。1 1月份茎中梓醇含量较高,9月份毛蕊花糖苷含量较高,且密度越大毛蕊花糖苷含量越高。块根中梓醇含量均为9月份最高,且密度越小含量越高;毛蕊花糖苷随着地黄根的发育逐渐升高,密度越大含量越高。3.利用高通量测序技术,对地黄85-5和J9 2个品种在不同发育时期不同种植密度下的块根和叶片共24个样品进行转录组测序分析。结果发现同一个地黄品种同一器官(组织)不同发育阶段、不同密度处理之间的样品间基因表达量相关性较强,叶片和块根之间基因表达量相关性较差。差异基因表达分析显示,不同密度下地黄85-5叶中差异表达基因较少,且密度差异越大差异基因越多;地黄块根的发育高密度受到较大影响,高密度下的差异基因更多;J9不同种植密度叶中的差异表达基因均比较多,其中多数基因在高密度中下调表达,在块根中不同密度下差异基因的数量很多,且中低密度间的差异基因反而更多。分析了与地黄块根膨大、药效成分梓醇和毛蕊花糖苷合成相关的基因表达特性,发现扩展蛋白基因在85-5块根中表达量较高,且随着密度增加表达量逐渐降低,J9中扩展蛋白基因对于密度的响应规律性不强。筛选出一些与地黄梓醇和毛蕊花糖苷含量变化规律一致的催化酶基因和转录因子,初步阐明了密度引起梓醇和毛蕊花糖苷含量变化的分子机理。4.环烯醚萜合酶(IS)是环烯醚萜类成分合成途径的关键酶,可以催化10-oxogeranial生成烯醇化物中间体Epi-iridodial。本文通过同源比对,在地黄转录组中筛选出4条与长春花CrIS同源的cDNA序列,长度分别在1425bp～1743 bp之间,依次命名为RgIS1、RgIS2、RgIS3和RgIS4。它们编码389～392个氨基酸残基,蛋白质分子量在44.30 kD～44.74 kD之间,等电点pI在5.30～5.87之间,亚细胞定位预测均分布在细胞质中。序列分析表明地黄4个环烯醚萜合酶的氨基酸序列均包含6个保守的短链脱氢酶/还原酶(SDR)基序,其三维结构包含N端Rossmann结构域和C端伸展结构域。进化分析表明,RgIS3与CrIS、橄榄OeIS聚在同一类群,另外3个环烯醚萜合酶与其它植物的15个蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,RgIS1和RgIS3可能是参与梓醇合成的关键催化酶基因。构建了RgIS3的过量表达载体,以农杆菌转化法导入地黄基因组,获得了一批转化苗,为进一步研究环烯醚萜合酶基因在梓醇合成中的分子功能奠定基础。