谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质,它可通过激活不同的突触前或突触后谷氨酸受体参与脊髓伤害性信息的传递和痛觉过敏的形成。由于细胞外液中没有谷氨酸代谢酶,单纯扩散所需的时间又很长,所以中枢神经系统内细胞外谷氨酸的稳态主要依靠高效性谷氨酸转运体系统来实现。目前,已经克隆出5种高亲和力谷氨酸转运体,包括EAAT1(GLAST)、EAAT2(glial glutamate transpor-1,GLT-1)、EAAT3(EAAC1)、EAAT4、EAAT5。其中,GLT-1在突触间隙谷氨酸的清除和突触传递的终止中起主要作用。已有研究表明,GLT-1参与病理性痛和痛过敏的形成和维持。如,在坐骨神经慢性结扎损伤(chronic constriction injury,CCI),以及慢性吗啡耐受等模型中,均伴有脊髓后角GLT-1表达的下调和/或摄取功能的下降。而应用谷氨酸转运体摄取促进剂后,则可减轻CCI诱导的痛及痛过敏。给正常大鼠椎管内注射谷氨酸转运体的抑制剂TBOA(DL-threo-beta-benzyloxyaspartate)后,大鼠出现自发痛行为和痛觉过敏现象。以上结果提示,阻断GLT-1的表达和功能,加重痛觉过敏,而增强GLT-1的表达和功能,则可以产生抗伤害性作用。因此,对GLT-1进行调制,增强其摄取细胞外液谷氨酸的能力,可能成为神经病理性痛治疗研究的新靶点。而更特异、并且无明显毒副作用的GLT-1激动剂的发现则是实现上述设想的前提。Rothstein等2005年在《Nature》上报道,β-内酰胺类抗生素,如头孢曲松钠(Ceftriaxone,Cef),可以特异性地增加GLT-1的表达和对谷氨酸的摄取。这一发现为证明上述设想提供了可能。因此,本实验旨在观察β-内酰胺类抗生素Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏、以及脊髓GLT-1表达和摄取功能的影响,为临床上病理性痛的防治提供新线索和思路,为阐明GLT-1在神经病理性痛中的作用提供实验依据。1腹腔注射Cef抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏、上调其脊髓后角GLT-1的表达观察不同时间点腹腔给予Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏及脊髓后角GLT-1蛋白表达的影响,为证明Cef通过调制脊髓GLT-1发挥抗慢性神经病理性痛过敏的作用提供实验依据。方法:选用雄性Sprague-Dawley大鼠130只,随机分为5组:①Sham组(n=25):选用5只大鼠,仅暴露其右侧坐骨神经而不结扎,并于术前1 d、术后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d和21 d连续观察其热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。最后一次行为学测定结束后取材,应用Western blot技术,观察脊髓后角GLT-1的表达。另选用20只大鼠,分别于Sham术后7 d和15 d取材,每个时间点10只动物(5只用于Western blot分析,5只用于免疫组化染色),观察脊髓后角GLT-1的表达,作为CCI组或其它各组在CCI过程中GLT-1表达动态变化的对照。②CCI组(n=25):行大鼠右侧坐骨神经CCI,其它步骤及动物配置同Sham组。③Cef组(n=5):正常大鼠,腹腔注射Cef(200 mg/Kg),每日一次,连续7 d。于注射Cef前1 d、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d和21 d连续观察其热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。同时设腹腔注射生理盐水(NS,Cef溶剂)对照组(n=5)。④CCI+i.p.Cef预防组(n=20):于大鼠CCI术后当天开始腹腔注射Cef(200 mg/Kg),每日一次,连续7 d。其它实验步骤及动物配置同Sham组,但15 d组仅做Western blot分析(n=5)。同时设腹腔注射NS(Cef溶剂)对照组(n=20)。⑤CCI+i.p.Cef治疗组(n=15):于CCI术后第9 d开始腹腔注射Cef(200 mg/Kg),每日一次,连续7 d。其它实验步骤及动物配置同Sham组,但仅观察15 d和21 d两个时间点脊髓后角GLT-1表达的变化。同时设腹腔注射NS(Cef溶剂)对照组(n=15)。结果:单纯腹腔注射Cef对正常大鼠痛阈无显著影响。Sham组大鼠Sham手术侧(右侧)后肢的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值在所观察的21 d内均无明显变化。CCI诱导大鼠产生了热和机械性痛觉过敏,表现为从CCI术后第3 d开始,大鼠CCI侧后肢开始出现明显的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的降低(P<0.05),于7 d时降至最低值,并持续到所观测的21 d。Cef预防组大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于术后3 d起,机械缩足反射阈值于术后5 d起,至所观察的21 d为止,均较CCI组显著升高(P<0.05)。Cef治疗组大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于术后11 d起,机械缩足反射阈值于术后15 d起,至所观察的21 d为止,均较CCI组显著升高(P<0.05)。无论预防性还是治疗性给予NS(Cef的溶剂)对CCI诱导的热和机械性痛敏均无显著影响。以上结果表明,腹腔注射Cef具有抗CCI诱导的大鼠热和机械性痛觉过敏作用,但Cef抗机械性痛觉过敏的作用不如抗热痛觉过敏的作用明显。免疫组化染色显示,Sham组大鼠脊髓后角腰5(L5)节段各层均可见棕黄色的GLT-1免疫反应阳性颗粒,染色较浅。CCI术后7d和15d时,CCI同侧脊髓后角浅层GLT-1免疫反应阳性颗粒的显著减少。Western blot分析显示,GLT-1在Sham组有一定基础表达;与Sham组相比,CCI术后7 d、15 d和21 d时,脊髓后角GLT-1蛋白表达下调,表现为GLT-1与β-actin的IOD值的比值降低(P<0.05)。与CCI组相比,NS对照组GLT-1表达无明显变化,而腹腔预防性给予Cef,可显著增加CCI术后7 d时脊髓后角浅层GLT-1免疫反应阳性颗粒,并上调CCI术后7 d、15 d和21 d时脊髓后角GLT-1蛋白的表达(western blot)(P<0.05);同样,腹腔治疗性给予Cef,可显著增加CCI术后15 d时脊髓后角浅层GLT-1免疫反应阳性颗粒,并上调CCI术后15 d和21 d时脊髓后角GLT-1蛋白的表达(western blot)(P<0.05)。Cef的这种上调GLT-1表达的作用与其抗CCI诱导的慢性神经病理性痛的作用在时间特征上相一致。以上结果提示,Cef具有抗CCI诱导的伤害性感受作用,Cef的这种作用可能是通过上调脊髓GLT-1的表达而实现的。2椎管内注射Cef抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏观察不同时间点椎管内给予Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的影响,为证明Cef通过调制脊髓GLT-1发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用提供进一步的实验依据。方法:选用雄性Sprague-Dawley大鼠60只,随机分为7组(n=5):①Sham组:仅暴露大鼠右侧坐骨神经而不结扎,并于术前1 d、术后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d和21 d连续观察其热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。②CCI组:行大鼠右侧坐骨神经CCI,其它步骤同Sham组。③Cef组:正常大鼠,椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。于注射Cef前1 d、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d和21 d连续观察其热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组。④CCI+i.t.Cef预防组:于CCI术后当天开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。其它步骤同Sham组。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组。⑤CCI+i.t.Cef治疗组:于CCI术后第9 d开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。其它步骤同Sham组。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组。⑥As-ODNs+CCI+i.t.Cef预防组:在CCI+i.t.Cef预防组椎管内给予Cef的基础上,于CCI术后1.5 d和3.5 d时分别椎管内注射GLT-1反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,As-ODNs)18 nmol。其它步骤同Sham组。同时设椎管内注射双蒸水(DW,As-ODNs溶剂)对照组。⑦As-ODNs+CCI+i.t.Cef治疗组:在CCI+i.t.Cef治疗组椎管内给予Cef的基础上,于CCI术后10.5 d和12.5 d时分别椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol。其它步骤同Sham组。同时设椎管内注射DW(As-ODNs溶剂)对照组。结果:单纯椎管内注射Cef对正常大鼠痛阈无明显影响。而椎管内预防性给予Cef后(CCI+i.t.Cef预防组),大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于CCI术后3 d起,至所观察的21 d为止,较CCI组显著升高(P<0.05);椎管内治疗性给予Cef后(CCI+i.t.Cef治疗组),大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于CCI术后11 d起,至所观察的21 d为止,较CCI组显著升高(P<0.05)。椎管内预防性或治疗性给予Cef后,机械缩足反射阈值与CCI组相比也显著升高(P<0.05),但升高程度不及热缩足反射潜伏期明显。无论预防性还是治疗性给予NS(Cef的溶剂)对CCI诱导的热和机械性痛敏均无显著影响。椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol后,显著抑制了Cef对CCI诱导的慢性神经病理性痛过敏的预防和治疗作用,表现为热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的重新降低(P<0.05)。同时椎管内注射GLT-1 As-ODNs也显著抑制了Cef诱导的脊髓后角GLT-1表达的上调(详见第3部分结果)。椎管内注射双蒸水对痛行为及GLT-1的表达均无明显影响。以上结果表明,椎管内注射Cef可抑制CCI大鼠的痛行为反应。3椎管内注射Cef可显著上调CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表达观察不同时间点椎管内给予Cef对CCI大鼠脊髓后角GLT-1表达的影响,探讨Cef抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏作用的机制。方法:选用雄性Sprague-Dawley大鼠195只,随机分为6组:①Sham组(n=35):仅暴露大鼠右侧坐骨神经而不结扎,分别于Sham术后5 d、7 d、13 d、15 d和21 d取大鼠腰4至腰6节段(L4-L6)脊髓后角,观察GLT-1的表达。其中,7 d和15 d组每组10只动物,5只做Western blot分析,5只做免疫组化染色;5 d、13 d和21 d组每组5只动物,仅做Western blot分析。②CCI组(n=30):行大鼠右侧坐骨神经CCI,其余步骤同Sham组,但仅观察CCI术后7 d、15 d和21 d时脊髓后角GLT-1的表达。另取CCI术后5 d组(另设,n=5)和7 d组大鼠的大脑皮质中央后回顶部脑组织,应用Western blot法检测其GLT-1的表达,作为脊髓GLT-1表达的对照。③CCI+i.t.Cef预防组(n=25):于大鼠CCI术后当天开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。其余步骤和动物配置同Sham组,但仅观察CCI术后5 d、7 d、15 d和21 d时脊髓后角GLT-1的表达,并且15 d组也仅做Western blot分析(n=5)。另取5 d组和7 d组大鼠的大脑皮质中央后回顶部脑组织,应用Western blot法检测其GLT-1的表达,作为脊髓GLT-1表达的对照。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组(n=25)。④CCI+i.t.Cef治疗组(n=20):于CCI术后第9 d开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。其余步骤同Sham组,但仅观察CCI术后13 d、15 d和21 d时脊髓后角GLT-1表达的变化。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组(n=20)。⑤As-ODNs+CCI+i.t.Cef预防组(n=10):在CCI+i.t.Cef预防组椎管内给予Cef的基础上,于CCI术后1.5 d和3.5 d时分别椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol。于CCI术后5 d和7 d(每个时间点5只动物)取大鼠L4-L6节段脊髓后角,应用Western blot技术,测定其GLT-1表达的变化。同时设椎管内注射DW(As-ODNs溶剂)对照组(n=10)。⑥As-ODNs+CCI+i.t.Cef治疗组(n=10):在CCI+i.t.Cef治疗组椎管内给予Cef的基础上,于CCI术后10.5 d和12.5 d时分别椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol。于CCI术后13 d和15 d(每个时间点5只动物)取大鼠L4-L6节段脊髓后角,应用Western blot技术,测定其GLT-1表达的变化。同时设椎管内注射DW(As-ODNs溶剂)对照组(n=10)。结果:椎管内预防性给予Cef,可显著增加CCI术后7 d时脊髓后角浅层GLT-1免疫反应阳性颗粒,并上调CCI术后7 d、15 d和21 d时脊髓后角GLT-1蛋白的表达(western blot)(P<0.05)。同样,椎管内治疗性给予Cef,可显著增加CCI术后15 d时脊髓后角浅层GLT-1免疫反应阳性颗粒,并上调CCI术后15 d和21 d时脊髓后角GLT-1蛋白的表达(western blot)(P<0.05),而椎管内注射NS对CCI大鼠脊髓后角GLT-1表达无明显影响。另外,Western blot分析显示,与CCI组相比,椎管内注射Cef或NS,大鼠大脑皮质中央后回顶部区域(脊髓以外区域)GLT-1表达无显著性差异。上述结果表明,椎管内注射Cef可显著并特异性地上调CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表达。与椎管内注射Cef组相比,无论是As-ODNs+CCI+i.t.Cef预防组还是As-ODNs+CCI+i.t.Cef治疗组,椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol后,均显著地抑制了Cef对CCI大鼠脊髓后角GLT-1表达的上调作用(P<0.05),而椎管内注射双蒸水则对Cef的这种作用无明显影响,表明GLT-1 As-ODNs抑制了GLT-1表达。并且,椎管内注射GLT-1 As-ODNs后,伴随着对脊髓后角GLT-1表达上调的抑制,还显著抑制了Cef对CCI诱导的慢性神经病理性痛过敏的预防和治疗作用(详见第2部分结果)。GLT-1 As-ODNs对GLT-1表达的抑制作用与其对痛行为的影响在时间特征上相一致,表明Cef通过上调脊髓GLT-1的表达发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用。4椎管内注射Cef增强CCI大鼠脊髓后角GLT-1对谷氨酸的摄取观察不同时间点椎管内给予Cef对CCI大鼠脊髓后角GLT-1对[3H]-谷氨酸摄取的影响,探讨Cef对脊髓后角GLT-1功能的影响,为证明Cef通过调制脊髓GLT-1发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用提供进一步的实验依据。方法:选用雄性Sprague-Dawley大鼠60只,随机分为6组:①Sham组(n=10):仅暴露大鼠右侧坐骨神经而不结扎,于Sham术后5 d(n=5)和14 d(n=5)取材观察。②CCI组(n=10):行大鼠右侧坐骨神经CCI,其它步骤同Sham组。③CCI+i.t.Cef预防组(n=5):于CCI术后当天开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。于CCI术后5 d取材观察。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组(n=5)。④CCI+i.t.Cef治疗组(n=5):于CCI术后第9 d开始椎管内注射Cef(502 nmol/kg),每日一次,连续5 d。于CCI术后14 d取材观察。同时设椎管内注射NS(Cef溶剂)对照组(n=5)。⑤As-ODNs+CCI+i.t.Cef预防组(n=5):在CCI+i.t.Cef预防组基础上,于CCI术后1.5 d和3.5 d时分别椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol。其它同CCI+i.t.Cef预防组。同时设椎管内注射DW(As-ODNs溶剂)对照组(n=5)。⑥As-ODNs+CCI+i.t.Cef治疗组(n=5):在CCI+i.t.Cef治疗组基础上,于CCI术后10.5 d和12.5 d时分别椎管内注射GLT-1 As-ODNs 18 nmol。其它同CCI+i.t.Cef治疗组。同时设椎管内注射DW(As-ODNs溶剂)对照组(n=5)。以上各组均于相应时间点取大鼠L4-L6节段脊髓后角,测定GLT-1对[3H]-谷氨酸的摄取。结果:与Sham组相比,CCI组大鼠脊髓后角GLT-1对谷氨酸的摄取明显降低(P<0.05)。与CCI组相比,椎管内预防性(CCI+i.t.Cef预防组)和椎管内治疗性(CCI+i.t.Cef治疗组)给予Cef后,脊髓后角GLT-1对谷氨酸的摄取均显著升高(P<0.05),而椎管内注射NS对照组脊髓后角GLT-1对谷氨酸的摄取无显著变化。与CCI+i.t.Cef预防组和CCI+i.t.Cef治疗组相比,As-ODNs+CCI+i.t.Cef预防组和As-ODNs+CCI+i.t.Cef治疗组GLT-1对谷氨酸的摄取均显著降低(P<0.05),而双蒸水对照组GLT-1对谷氨酸的摄取无显著变化。以上结果表明,椎管内注射Cef可增强CCI大鼠脊髓后角GLT-1对谷氨酸的摄取功能。结论(1)腹腔注射Cef后,减轻了CCI诱导的慢性神经病理性痛过敏,同时上调了CCI大鼠脊髓后角GLT-1蛋白的表达,提示Cef通过上调脊髓GLT-1的表达发挥抗大鼠慢性神经病理性痛过敏作用。(2)椎管内给予Cef,同样可发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏作用,并可特异性上调CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表达,增强其对谷氨酸的摄取,这些作用可被椎管内给予GLT-1 As-ODNs所抑制。(3)上述结果表明,Cef可通过上调CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表达,增加其对谷氨酸的摄取而发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用。因为Cef已在临床上作为抗生素广泛应用,本研究结果对应用Cef作为疼痛管理用药提供了实验依据。