论文部分内容阅读
目的：研究显示miR-27a/b参与调控动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）发生发展的众多危险因素，其在As中的可能机制已由我们进行文献归纳整理，并发表在《Atherosclerosis》，基于本研究团队的工作，我们提出miR-27a/b通过调控影响胆固醇流出的关键蛋白ABCA1参与影响As的发生发展。因此，本论文拟探讨miR-27a/b对ABCA1的表达及其介导的胆固醇流出的影响。方法：运用生物信息学的方法对miR-27a和miR-27b序列的保守性、区别、存在区域进行分析，并重点分析miR-27a/b与ABCA1的结合情况（包括保守性、结合位点、得分、结合自由能、结合碱基特征等）；双荧光素酶报告基因检测miR-27a/b与ABCA1的结合情况；转染miR-27a/b mimics或inhibitor，采用qPCR和Western blot检测人THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞、小鼠RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞、人HepG2细胞中ABCA1mRNA和蛋白表达情况；采用H3标记的胆固醇孵育的方法，运用液体闪烁计数器（liquid scintillation counter）分析THP-1细胞内的胆固醇流出情况，高效液相色谱仪（High Performance LiquidChromatography, HPLC）检测THP-1细胞内的总胆固醇、胆固醇酯和游离胆固醇含量，并计算胆固醇酯和游离胆固醇的比值；采用siRNA技术沉默ABCA1后，与miR-27a/b mimics共转染，进一步评价miR-27a/b对THP-1细胞胆固醇流出的影响。结果：生物信息学显示miR-27a属于基因间区域miRNA，定位于19号染色体p13.13，miR-27b属于内含子型miRNA，定位于9号染色体q22.32，两者都高度保守且只有一个碱基序列不同，miR-27a/b具有靶向结合ABCA1的基础，且高度保守、得分较高、结合自由能较低；miR-27a/b mimics能够显著降低野生型的ABCA1荧光素酶活性，但对突变型的却无显著影响；miR-27a/b mimics能够显著降低THP-1和RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞、HepG2细胞ABCA1mRNA和蛋白表达，miR-27a/b inhibitor则出现相反的结果；miR-27a/b mimics能够显著降低apoA-1介导的胆固醇流出，且ABCA1在其中发挥关键作用，miR-27a/binhibitor则增加细胞内的胆固醇流出；miR-27a/b mimics能显著降低细胞内的胆固醇酯含量，增加细胞内的游离胆固醇含量，降低胆固醇酯和游离胆固醇的比值，miR-27a/b inhibitor则出现相反的结果，但miR-27a/b mimics/inhibitor却都不影响细胞内总胆固醇含量，提示miR-27a/b不仅影响细胞内的胆固醇流出，还可能影响细胞内胆固醇的摄取、合成、酯化和水解。结论：miR-27a/b能够通过靶向沉默ABCA1减少细胞内的游离胆固醇流出，但并不影响细胞内的总胆固醇水平。