论文部分内容阅读
实验目的 类风湿性关节炎(Rheumatiod arthritis,RA)是一种全身性自身免疫病,是最常见的慢性炎性疾病之一。它具有慢性、进行性和侵袭性等特点,主要特征表现为不断增生的滑膜血管翳组织和受到侵袭破坏的软骨和骨骼。其中,类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-Fibroblast-like synovial cells,RA-FLS)是增生滑膜的重要组成成分,具有类肿瘤样特征,参与类风湿性关节炎的发生和发展过程,并在类风湿性关节炎的起始和发展过程中起主要作用,因此,针对性治疗类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞从而达到治疗类风湿性关节炎的目的是本研究的侧重点。严重的类风湿性关节炎患者常表现关节活动受限,躯体残疾,甚至工作能力丧失,最终导致生活质量下降及寿命缩短,给患者、家庭和社会带来严重的经济负担。故尽早诊断并开始治疗以控制类风湿性关节炎症反应,预防带来的后续损伤显得尤为重要。万通筋骨片是富含多种传统中药的中药复方,它具有“祛风散寒、通络止痛”等功效,已长期应用在类风湿性关节炎的治疗中,并获得了良好的口碑。然而,万通筋骨片的活性成分未知,且治疗类风湿性关节炎的作用机制尚不清楚。因此,本研究的主要目的是通过药理学研究手段,研究万通筋骨片活性成分对类风湿性成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和侵袭的影响,初步探究万通筋骨片治疗类风湿性关节炎的潜在机制。结合天然产物成分分析技术,初步分离鉴定万通筋骨片中活性成分。为药效的进一步提升,新适应症的发掘,安全性的评估提供理论基础。实验方法 通过药理实验:CCK8实验检测药物对RA-FLS细胞活性的影响、克隆形成实验检测药物对RA-FLS细胞增殖的影响、Hoechst检测药物对RA-FLS细胞核形态的影响、细胞划痕实验检测药物对RA-FLS细胞迁移的影响及Transwell实验检测药物对RA-FLS细胞迁移和侵袭的影响。通过以上实验,探究万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭的影响。同时应用天然产物化学知识,利用超高效液相-四极杆-飞行时间质谱((Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)结合数据库对比的方法对万通筋骨片进行了全成分的分析和鉴定,通过气相色谱与质谱连用技术(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)分析万通筋骨片挥发性成分。实验结果 1.万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLS细胞增殖、迁移和侵袭的影响(1)CCK8检测乙醇提取物对RA-FLS细胞活性的影响,结果显示空白组RA-FLS的细胞增殖速度相对较快,而各给药剂量组RA-FLS的细胞增殖速度呈现不同程度的下降,以4mg/m L剂量组最为明显。在药物作用后12h时,各给药剂量组之间细胞增殖情况没有明显改变;在药物作用后24h时,4mg/m L剂量组与空白组相比有统计学意义(p<0.05);在药物作用后36h时,3mg/m L和4mg/m L剂量组与空白组相比有统计学意义(p<0.05);在药物作用后48h时,与空白对照组相比,2mg/m L剂量组具有统计学差异(p<0.05),3mg/m L和4mg/m L剂量组具有显著的统计学意义(p<0.01);在药物作用后72h时,2mg/m L、3mg/m L和4mg/m L剂量组均具有显著的统计学意义(p<0.01),结果表明乙醇提取物对RA-FLS细胞活性的影响呈现剂量和时间依赖性。(2)克隆形成实验检测乙醇提取物对RA-FLS细胞增殖的影响,在细胞药物作用24h,与空白对照组相比,1mg/m L、2mg/m L和3mg/m L剂量组的细胞数量均没有发生明显改变(p>0.05),4mg/m L剂量组细胞数量具有统计学差异(p<0.05)。在细胞药物作用48h,与空白对照组相比,1mg/m L剂量组没有发生明显改变(p>0.05),2mg/m L、3mg/m L和4mg/m L剂量组细胞数量均具有统计学差异(p<0.05)。这与CCK8测得的结果相一致。(3)Hoechst检测乙醇提取物对RA-FLS细胞核形态影响的结果,结果表明乙醇提取物作用24h后,空白组和1mg/m L剂量组的细胞核形态没有发生明显的改变;2mg/m L、3mg/m L和4mg/m L剂量组的细胞核形态均开始发生改变,且形态变异率呈剂量依赖性。乙醇提取物作用48h后,空白组细胞核形态正常,大小均一;1mg/m L、2mg/m L、3mg/m L和4mg/m L剂量组的细胞核形态均发生改变,大小差异明显。(4)细胞划痕实验检测乙醇提取物对RA-FLS细胞迁移的影响,结果表明乙醇提取物作用RA-FLS细胞12h时,与空白对照组相比,1mg/m L、2mg/m L和3mg/m L剂量组细胞的迁移距离没有发生明显的改变(p>0.05);乙醇提取物作用RA-FLS细胞24h时,与空白对照组相比,1mg/m L剂量组细胞迁移距离不具有统计学意义(p>0.05),2mg/m L和3mg/m L剂量组细胞的迁移距离均有统计学差异(p<0.05)。(5)Transwell检测乙醇提取物对RA-FLS细胞迁移的影响,结果如下:乙醇提取物作用RA-FLS细胞12h时,与空白对照组相比,1mg/m L和2mg/m L剂量组内穿过Transwell小室的细胞数没有发生明显改变(p>0.05),3mg/m L剂量组的迁移细胞数具有统计学差异(p<0.05);乙醇提取物作用RA-FLS细胞24h时,与空白对照组相比,1mg/m L剂量组的迁移细胞数没有发生显著改变(p>0.05),2mg/m L剂量组迁移细胞数具有统计学差异(p<0.05),3mg/m L剂量组的迁移细胞数具有显著的统计学意义(p<0.01)。(6)Transwell检测乙醇提取物对RA-FLS细胞侵袭的影响,结果显示:乙醇提取物作用RA-FLS细胞12h时,与空白对照组相比,1mg/m L剂量组内细胞穿过水凝胶的细胞数没有明显减少(p>0.05),2mg/m L和3mg/m L剂量组内细胞穿过水凝胶的细胞数减少,且具有统计学差异(p<0.05);乙醇提取物作用RA-FLS细胞24h时,与空白对照组相比,1mg/m L剂量组内细胞穿过水凝胶的细胞数没有明显减少(p>0.05),2mg/m L剂量组内细胞穿过水凝胶的细胞数减少,且具有统计学差异(p<0.05),3mg/m L剂量组内细胞穿过水凝胶的细胞数减少,且具有显著的统计学差异(p<0.01)。结果显示,万通筋骨片的乙醇提取物对RA-FLS侵袭能力的抑制作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。2.天然产物活性成分分析(1)通过UHPLC-QTOF-MS方法得到万通筋骨片全部组成307种成分和正负离子TIC图谱;(2)通过GC-MS方法得到万通筋骨片15种挥发性组成成分以及图谱。结论 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLS的增殖、迁移和侵袭能力具有一定的抑制作用,且呈现一定的剂量和时间依赖性。万通筋骨片的全部成分共307种化合物;挥发性成分15种化合物,含量最高的为d-杜松烯。其中部分活性成分如淫羊藿次苷、小檗碱、马钱子苷等已报到具有抗炎效果。