本实验以广西水牛睾丸作为研究材料。通过分析比较多个不同物种睾丸间质细胞的培养方法,首次体外成功培养出水牛睾丸间质细胞,并对其进行冷冻保存等相关研究,然后通过质谱联用技术鉴定出该细胞内总蛋白的种类,本研究主要分为四个试验。试验一：初步建立水牛睾丸间质细胞体外培养体系。通过综合参考不同物种睾丸间质细胞的体外培养方法,对培养皿的选择、胶原酶的消化时间长短、Percoll的使用方法等一一对比。结果发现,选择CORNING公司的培养皿,胶原酶Ⅳ消化30-40min, Percoll配置成1.090、1.080、1.065、1.045四个梯度,并在培养6h之后更换细胞培养液,能够得到最大纯度的水牛睾丸间质细胞。试验二：对试验一中生长状态良好的水牛睾丸间质细胞进行冻融操作。结果发现：①生长天数小于3d时,用0.25%胰蛋白酶与4倍体积的PBS相结合,需要消化3min左右。生长天数大于7d时,消化时间需延长至30-40min。②与原代培养的睾丸间质细胞相比,传代之后,细胞的生殖及增殖能力明显下降。③间质细胞冷冻保护剂配方为：70%DMEM/F12培养液(无血清)+20%FBS(胎牛血清)+10%DMSO。试验三：分别用0IU、25IU、50IU、100IU的人绒毛膜促性腺激素(HCG)对试验一中得到的原代间质细胞进行刺激试验(0IU为对照组)。并用牛睾酮试剂盒检测细胞培养液中雄激素睾酮的水平,结果表明,不同浓度的HCG,间质细胞产生的雄激素水平不同,且当HCG浓度为50IU时,睾丸间质细胞产生雄激素的量最大。试验四：运用液相色谱和质谱联用技术,初步鉴定水牛睾丸间质细胞,我们得到了3062个蛋白质。在代谢通路方面,有很多代谢通路和睾丸间质细胞的生理功能有关,其中甾族化合物代谢通路就是睾丸间质细胞合成雄性激素的途径,在所得到的蛋白质中,我们鉴定到有4种蛋白质参与甾类体化合物的合成途径：P450cytochrome P450、lanosterol synthase、sterol o-acyltransferase1、NAD(P)dependent steroid dehydrogenase-like。总之,本研究在综合多个物种睾丸间质细胞体外培养方法的基础上,初步建立了一套较适合水牛睾丸间质细胞体外分离培养的体系,并成功对细胞进行纯度鉴定,关于细胞传代、冻存培养也有一定的研究；而且初步筛选出与睾丸间质细胞产生雄激素相关的重要蛋白,为后期水牛雄性生殖机理的研究提供一定的线索。