论文部分内容阅读
蜈蚣草是世界上发现的第一种砷超富集植物,具有极为高效的砷吸收、转运及富集能力。在自然环境中,砷酸盐[As(V)]是好气土壤中砷的主要存在形态,同时也是蜈蚣草吸收砷的主要来源。由于As(V)与磷酸盐(Pi)的化学结构相似,As(V)主要通过Pi转运途径被植物吸收。高亲和磷酸盐转运蛋白(High affinity phosphate transporter;Pht1)家族基因在植物吸收土壤中正磷酸盐的过程中发挥关键的作用,是As(V)进入植物体的主要途径。本研究中,我们对超富集植物蜈蚣草中的PvPht1家族蛋白进行了检索分析,并对其中PvPht1;4基因进行了克隆和功能鉴定,阐明了PvPht1;4基因在植物Pi、As(V)吸收转运过程中的作用。通过在蜈蚣草转录组数据库中检索比对,本研究共获得了5个PvPht1家族基因PvPht1;1-5,其中PvPht1;4、PvPht1;5均为在蜈蚣草中首次发现的PvPht1家族基因。生物信息学分析结果表明,PvPht1家族成员间序列较为保守,其中PvPht1;3和PvPht1;4的序列一致性较高、亲缘关系较近,可能具有相似的As(V)/Pi吸收功能;在PvPht1;1-1;5的表达模式鉴定中,PvPht1;4主要在蜈蚣草根系表达,并受缺磷和As(V)胁迫的诱导表达上调,可能参与了蜈蚣草高效的As(V)/Pi吸收过程。对PvPht1;4的蛋白三级结构及跨膜结构预测结果显示,PvPht1;4编码一个典型的磷酸盐转运蛋白;进一步的亚细胞定位结果显示,PvPht1;4定位在细胞膜上,负责Pi从细胞外向细胞内的跨膜运输;为了明确PvPht1;4转运As(V)、Pi的动力学特征,在酵母异源表达系统中对PvPht1;4的As(V)、Pi转运能力进行鉴定,结果显示:PvPht1;4对Pi的转运能力强于PvPht1;3,对As(V)的转运能力强于PvPht1;2,PvPht1;4蛋白具有高效的Pi和As(V)转运功能,可能在蜈蚣草根系高效吸收As(V)的过程中发挥重要作用。通过植物转基因的方法,我们构建并鉴定了多个表达PvPht1;4的烟草株系,并利用PvPht1;4表达烟草株系对PvPht1;4在植物中的功能进行鉴定。结果发现,表达PvPht1;4烟草对As(V)的吸收速率显著上升,根系砷含量增加了19-24%,但向地上部转运的砷显著降低37-55%,木质部汁液中的砷含量显著下降42-94%;砷污染土培实验显示出与水培实验一致的结果,表明PvPht1;4在烟草中的异源表达增强了烟草的砷抗性并降低了砷向烟草地上部的运输。考虑到烟草内源Nt Pht1家族基因可能因其自身的表达变化影响转基因烟草的砷积累,我们对烟草中可能参与Pi吸收转运过程的Nt Pht1;1、Nt Pht1;2、Nt Pht1;6进行鉴定,结果显示烟草中Nt Pht1基因不受PvPht1;4表达的影响。进一步鉴定烟草根系的砷代谢及解毒过程发现,表达PvPht1;4促进了烟草根系细胞内谷胱甘肽合成酶基因Nt GSH2的表达及GSH的合成;同时使液泡砷转运蛋白基因Nt ABCC1的表达显著上调48-70%,说明在表达PvPht1;4的转基因烟草根系细胞内,砷的络合及向液泡的隔离解毒过程显著增强。本研究首次鉴定了蜈蚣草中具有高效As(V)吸收功能的PvPht1;4蛋白,在烟草中异源表达PvPht1;4能有效阻隔砷向烟草地上部的运输,在构建低砷植物品种方面有良好的应用潜力。