在女性生殖系统恶性肿瘤中,卵巢癌的死亡率一直居高不下。尽管卵巢癌的发病率不高,但其长期的生存率令人堪忧,并且几十年来一直没有得到实质性改善,因此该肿瘤仍然是公共卫生领域的难题之一。据世界卫生组织估计,每年预计诊断出239,000例卵巢癌新患者,而其中152,000例患者将死于该癌症。卵巢癌按发病原因和组织学分类可以分为不同亚型,其临床行为和分子遗传学特征均有差异。在众多亚型中,高级别浆液性卵巢癌(High Grade Serous Ovarian Cancer,HGSOC)是最常见的,也是迄今为止最致命的,其早期症状不明显,在腹膜腔内广泛传播,大大增加了手术切除过程的难度。此外,虽然通常HGSOC对一线铂类化学疗法的初期反应非常好,但几乎都会复发,最终会产生耐药性。从基因上讲,除了涉及P53的突变之外,HGSOC中还有很多复发性启动子突变,其在基因组不稳定性和基因拷贝数改变中也起着更为重要的作用。因此,寻找高效低毒的治疗策略,挖掘可靠的治疗分子靶标,降低卵巢癌死亡率是亟待解决的重大问题。多聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-Ribose)Polymerase,PARP)抑制剂是首个经过临床批准的利用合成杀伤力设计的药物,并于2005年作为癌症靶向策略首次引入。它通过同源重组(Homologous Recombination,HR)途径使具有高度遗传复杂性和缺陷性DNA修复功能的晚期卵巢癌的治疗发生了重大变化。随着人们对于PARP生物学,DNA修复机制和PARP抑制剂作用机制的深入理解,PARP抑制剂与其他抗癌疗法的新型组合也变得越来越有挑战性。在已有的研究中,血管内皮生长因子,PD-1或PD-L1,抗CTLA4单克隆抗体,m TOR,AKT和PI3K抑制剂,MEK 1/2和WEE1抑制剂等都被证明与PARP抑制剂有联合作用,这些联合策略均是与HR通路相关。但是,我们仍然需要进一步的研究以更好地定义各种类型卵巢癌的治疗方案,从而便于各层次患者进行个体化治疗。众所周知,周期蛋白依赖性激酶4/6(Cyclin-Dependent Kinase4/6,CDK4/6)抑制剂主要阻断视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma,RB)的磷酸化,从而阻止了整个细胞周期的进展。几十年来,三种选择性抑制CDK4/6的药物已被联邦药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗晚期和转移性的雌激素受体阳性(Estrogen Receptor+,ER+)/人表皮生长因子受体2阴性(Human Epidermal Growth Factor receptor 2-,HER2-)乳腺癌。其中,Palbociclib(PD0332991)和Ribociclib(LEE011)已获批准与来曲唑联合用于一线治疗。但是随着不可避免的耐药性出现,越来越多的临床试验正在寻找潜在的生物靶标来预测CDK4/6抑制剂的有效性,从而为乳腺癌及其他癌症患者带来更多可选的治疗策略。目的:PARP抑制剂Olaparib和CDK4/6抑制剂Palbociclib是FDA批准的两种靶向药物,其治疗效果已经在临床上得到证实,但仍有患者对两种药物不敏感或者产生耐药性,因此我们迫切需要开发新的治疗策略以改善临床现状,尤其是当用于联合药物治疗的时候,我们还需要挖掘生物标志物为临床治疗提供标准,以区分不同类型患者,提供个体化的治疗方案。方法:在体外检测了PARP抑制剂Olaparib和CDK4/6抑制剂Palbociclib对包括HGSOC在内的卵巢癌细胞系的影响,同时挖掘了药物协同作用的潜在机制,并在体内实验中验证了两药联合的治疗效果。1、细胞系的联药反应:通过短期药敏实验在12种卵巢癌细胞系中进行Olaparib和Palbociclib的联药测试,发现有5种细胞系具有联药效果;通过克隆形成增殖实验在2D水平下检测了5种细胞系在长期药物处理下的联药差异;通过三维成球培养实验在3D水平下进一步证明两药在5种细胞系中的协同作用;通过流式实验检测5种细胞系分别在单药和联药作用下的Annexin V-Propidium Iodide(PI)表达量,以表征两药联合产生的凋亡效果。2、CDK4/6抑制剂Palbociclib的药物机制研究:通过对A2780细胞系进行转录组测序得到Palbociclib可以影响细胞系的E2F通路和HR通路,画出对应的基因集富集分析(GSEA)图和HR通路部分基因的热图;通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR)实验检测5种细胞系在单药和联药组中与HR通路相关基因的表达量,佐证转录组测序的结果。3、两药联合的表型验证:通过免疫荧光实验观察5种细胞系中的γH2AX和RAD51的灶点分布,表征细胞系的双链断裂损伤程度和HR修复水平;通过彗星实验测量尾距长度来检测5种细胞系分别在单药和联药组下的DNA损伤情况;通过中期染色体分散实验观察两药联合对5种细胞系基因组稳定性的影响。4、联合治疗靶标的挖掘:通过对A2780细胞系的转录组测序结果进一步分析得到Palbociclib单药组和联药组的MYC通路的GSEA分析图;通过q RT-PCR实验检测5种细胞系在单药和联药组中MYC通路下游LDHA和ODC1基因的表达量;通过蛋白质印记(Western blot)实验检测12种卵巢癌细胞系中的MYC表达水平并定量分析;通过RNA干扰技术和短期药敏实验研究5种细胞系在MYC缺失的情况下是否还具有联药效果。5、对联合治疗靶标的验证:通过逆转录病毒转染和短期药敏实验对IGROV1和SKOV3细胞系进行MYC过表达的处理和联药效果检测;通过流式实验(AV-PI)检测过表达MYC的IGROV1和SKOV3细胞系分别在单药和联药作用下的凋亡情况;通过q RT-PCR实验检测过表达MYC的IGROV1和SKOV3细胞系在单药和联药组中与HR通路相关基因的表达量;通过免疫荧光实验检测过表达MYC的IGROV1和SKOV3细胞系中的DNA损伤程度和HR修复水平;通过q RT-PCR实验检测卵巢癌细胞系中MYC本身与HR通路相关基因的表达水平的关系。6、联合策略的体内验证:通过皮下成瘤实验构建A2780卵巢癌细胞系移植瘤小鼠模型;通过腹腔注射和灌胃给药对实验鼠分别进行Olaparib和Palbociclib及其联合组的治疗,治疗期间每两天测量一次肿瘤体积,治疗结束后绘制小鼠肿瘤体积曲线,并收取肿瘤拍照;通过免疫组化染色实验检测短期治疗后肿瘤中各项指标的表达情况并定量分析;通过病理学染色实验观察长期治疗后各组肿瘤的形态学特征并定量分析。结果:PARP抑制剂Olaparib和CDK4/6抑制剂Palbociclib在5种包括HGSOC在内的卵巢癌细胞系中表现出协同作用,并显著诱导细胞产生更多凋亡。A2780细胞系中,与Palbociclib单药组相比,E2F和HR通路在对照组中的存在显著富集,且Palbociclib能显著下调5种有联药效果的细胞系中BRCA1、BRCA2和RAD51等HR通路相关基因的表达。与PARP或CDK4/6抑制剂单独处理相比,联合处理后可以使细胞内γH2AX表达量增加,RAD51表达量降低,并且引起更强的DNA损伤和更大幅度破坏细胞的基因组稳定性。A2780细胞系中,与Palbociclib单独处理或两药联合处理相比,两条MYC通路在对照组中存在显著富集,并且Palbociclib和联合用药能显著下调5种有联药效果的细胞系中MYC下游基因LDHA和ODC1的表达。值得注意的是,5种有联药效果的卵巢癌细胞系中的内源性MYC表达明显高于其他细胞系。卵巢癌细胞系中MYC与HR通路相关基因存在显著的表达正相关,且Palbociclib通过下调MYC依赖的与HR通路相关基因导致细胞系HR缺陷,从而与PARP抑制剂产生合成致死作用。此外,在高MYC表达卵巢癌细胞系移植瘤小鼠模型中,联用PARP抑制剂和CDK4/6抑制剂可以有效抑制肿瘤的生长,同时相关生物指标的变化与体外实验一致。结论:PARP抑制剂Olaparib和CDK4/6抑制剂Palbociclib的联合应用为临床上卵巢癌尤其是HGSOC患者提供了新的治疗思路,同时,MYC的表达水平也可以作为评估该联合策略适用性的生物标记物应用于MYC高表达或对PARP抑制剂与CDK4/6抑制剂单一疗法耐药的卵巢癌患者。