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小花棘豆Embellisia内生真菌含苦马豆素,牲畜食用植株导致中毒,引起草原畜牧业重大损失。真菌中苦马豆素合成代谢过程所知甚少,酵母氨酸还原酶为酵母氨酸合成的关键酶,酵母氨酸则是苦马豆素合成的关键中间物,因而酵母氨酸还原酶基因在内生真菌苦马豆素合成过程中起重要作用。课题组前期研究得到Embellisia内生真菌的酵母氨酸还原酶基因缺失突变株,本研究以内生真菌野生株OW7.8及酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为研究对象,用HPLC技术探索了不同生长时间下添加不同前体化合物(α-氨基己二酸、L-赖氨酸和L-吡啶羧酸)时野生株和突变株中苦马豆素动态变化,并作统计学分析;利用Southern blot检测野生株和突变株;对真菌酵母氨酸还原酶基因调控序列进行克隆与测序分析;构建了内生真菌酵母氨酸还原酶基因功能互补载体,并转化至大肠杆菌中进行初步功能验证,研究的主要结果如下:1.小花棘豆Embellisia内生真菌野生株OW7.8内苦马豆素含量普遍高于酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1内的苦马豆素含量。对照组中野生株OW7.8的苦马豆素含量在第29天达到最高值(3.678μg/mg),突变株M1苦马豆素含量在第23天达到最高值(0.041μg/mg)。2.当培养基内添加三种前体化合物后,OW7.8和M1内苦马豆素含量均高于对照组,添加前体化合物对野生株OW7.8苦马豆素合成的影响比对突变株M1的影响更显著。添加L-吡啶羧酸相对于其他两种前体物对菌株苦马豆素含量影响最大,OW7.8中其含量在第32天达最大值(19.547μg/mg),M1其含量在第26天达最大值(8.837μg/mg);添加α-氨基己二酸时,OW7.8中其含量在第26天达最大值(5.819μg/mg),M1中其含量在第17天达最大值(0.082μg/mg);添加赖氨酸时,OW7.8其含量第23天达最大值(7.381μg/mg),M1中的含量第20天达最大值(7.979μg/mg),添加赖氨酸更加促进突变株M1中苦马豆素的合成。3.Southern杂交结果显示:在野生株OW7.8检测到酵母氨酸还原酶基因中间序列;在突变株M1中检测到潮霉素磷酸转移酶基因,未检测到酵母氨酸还原酶基因中间序列。由此说明突变株M1中酵母氨酸还原酶基因被敲除,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到基因组中。4.利用基因组步移技术获得了内生真菌酵母氨酸还原酶基因5’和3’的部分侧翼序列,5’端为含酵母氨酸还原酶基因ORF的227 bp的1230 bp序列,3’端为含酵母氨酸还原酶基因ORF的223 bp的1500 bp序列,在ATG的5’上游发现有TATAAT、CAAT和CCGCCC保守序列,TAA的3’下游16bp处有AAAAA。5.构建了内生真菌酵母氨酸还原酶基因功能互补载体(pBARGPE-Sac),载体含gpdA启动子,trpC终止子,将酵母氨酸还原酶cDNA(1406 bp)定向插入,该穿梭载体在大肠杆菌内用Amp筛选,在真菌中用草胺膦筛选。将p BARGPE-Sac载体成功转化至大肠杆菌中表达。