经济的需要大大促进了对虾免疫学的研究。目前对虾养殖业的发展受到了各种感染性疾病的困扰。抗生素的使用虽然在一定程度上减轻了某些细菌性疾病对对虾养殖的破坏,但同时给环境和人类的健康造成了严重影响。抗菌肽是先天性免疫的重要成分,广泛存在于生物界的各个门类。对抗菌肽的研究有助于深入了解先天性免疫的理论基础,而且抗菌肽在水产养殖疾病防治中具有良好的应用前景,有望成为抗生素的替代品。模式识别蛋白在先天性免疫中发挥着十分重要的作用,它们能够识别病原微生物的表面抗原而启动机体免疫应答反应。本论文从中国明对虾血细胞中克隆了包括 Fenchin-Pen5,crustin 和 ALFFc 在内的三种抗菌肽(蛋白)基因和一种模式识别蛋白脂多糖及葡聚糖结合蛋白 (LGBP)基因,并对它们的组织分布及病原刺激下的表达变化进行了研究。 根据 EST 提示信息,通过 RACE 方法从中国明对虾血细胞中克隆了一条penaeidin 基因,分子结构上不同于已知的 3 种 penaeidin 亚类型(Pen2、Pen3 和Pen4),应属于一新的亚类型 Pen5 家族,故命名为 Fenchin-Pen5。Fenchin-Pen5 cDNA 全长 659 bp,编码 79 个氨基酸,其中包括 19 个氨基酸的信号肽,信号肽序列在对虾 penaeidin 中十分保守。成熟肽共含 60 个氨基酸残基,N 端有一个富含 Pro 的结构域,C 端则有 6 个保守的 Cys 残基,形成 3 对二硫键。Fenchin-Pen5与凡纳滨对虾和白滨对虾 penaeidin 的氨基酸序列具有 54%-60%的相似性。Fenchin-Pen5 成熟肽的理论分子量为 6446.53 Da,等电点为 9.55。RT-PCR 方法研究发现,Fenchin-Pen5 mRNA 在血细胞中有大量表达,另外在鳃、肠和卵巢中也有较弱表达,在肝胰脏和肌肉中几乎没有表达。半定量 RT-PCR 实验发现,注射灭活的混合细菌(鳗弧菌和金黄色葡萄球菌)后,对虾血细胞中 Fenchin-Pen5 mRNA 浓度在 6 -12 h 出现短暂的降低,尔后恢复正常。 从中国明对虾血细胞中克隆了一条 crustin 基因,cDNA 全长 489 bp,开放阅读框(ORF)长 390 bp,编码 113 个氨基酸残基,预测的信号肽包括 N 端 17个氨基酸残基。中国明对虾 crustin 成熟肽氨基酸序列与滨蟹的 11.5 kD 抗菌蛋白有 40%的相似性,与其他对虾 crusin 的相似性为 66%-76%。理论分子量为12324.5 Da,pI 为 8.5。与其他动物 crustin 一样,此 crustin 与蛋白酶抑制因子有柳峰松 中国明对虾抗菌因子及模式识别蛋白的研究 博士学位论文 2一定同源性,它们都含有一个由 8 个半胱氨酸残基构成的 4-DSC 核心。Northernblot 实验发现 crustin 基因在血细胞、鳃和肠中表达。进一步利用原位杂交验证crustin 转录专一地发生在血细胞中。利用毛细管电泳 RT-PCR 方法对 crustin 基因在血细胞中的表达进行了定量研究,结果发现未经灭活的鳗弧菌感染对虾后,crustin mRNA 浓度在 12 h 内迅速下降,24 h 开始回升,而在 48 h 后开始再次下降,随后的阶段(72 h-144 h)crustin 的表达维持较低水平。灭活的混合微生物感染实验中,crustin 表达只在 6 h 时出现短暂的下调迹象,其他时间均稳定在未刺激水平。结果表明 crustin 的转录不会因为微生物的刺激而加强。从中国明对虾血细胞中克隆的 ALFFc 基因,cDNA 全长 593 bp,ORF 长 369bp,编码 123 个氨基酸残基,推测的信号肽含有 25 个氨基酸残基。成熟肽含有98 个氨基酸残基,理论分子量 13799.16 Da,等电点 10.3,为阳离子多肽。ALFFc氨基酸序列与鲎的 ALF 之间具有 56%的相似性。组织表达模式与 crustin 相似,Northern blot 分析 ALFFc mRNA 出现在血细胞、鳃和肠中,原位杂交进一步证实 ALFFc 仅在血细胞中表达。定量实验发现,未经灭活的鳗弧菌感染后,对虾血细胞中 ALFFc 转录在 24 h 之内得到了明显加强,实验后期仍维持一个较高的表达水平。灭活的细菌注射后 6 h ALFFc 表达迅速上调,尔后的几个实验点(12h,24 h)逐步恢复,72 h 时前恢复正常。所以与 penaeidin 和 crustin 不同,微生物刺激下 ALFFc 的转录被明显加强。通过同源克隆和 SMART RACE 技术从中国明对虾血细胞中克隆了一条LGBP 基因,cDNA 全长 1275 bp,ORF 1098 bp,编码 366 个氨基酸残基,包括17 个氨基酸残基的信号肽。成熟肽 349 个氨基酸残基,理论分子量 39857 Da,等电点 4.39。LGBP 分子中含有两个推测的细胞整合位点 RGD(Arg-Gly-Asp)和一个葡聚糖酶的类似功能域,此功能域在葡聚糖酶中能起到识别并水解β-1,3-或β-1,4-糖苷键的作用。N-糖基化位点的存在暗示 LGBP 是一种糖蛋白。中国明对虾的 LGBP 氨基酸序列与细角滨对虾的 LGBP、斑节对虾的 BGBP、日本囊对虾的BGBP、欧洲龙虾的BGBP以及淡水小龙虾的LGBP具有很高同源性i,dentity分别为 90%、94%、87%、86%和 80%。RT-PCR 和 Northern blot 结果一致表明LGBP 基因的转录发生在所有被检测的组织中,包括血细胞、鳃、心脏、肌肉、淋巴器官、肝胰脏和肠。定量实验发现灭活细菌和 WSSV 感染后血细胞中 LGBP