木聚糖酶在造纸、食品和饲料等领域有广泛的应用前景,但是天然来源的木聚糖酶往往热稳定性较差,是限制其应用的主要因素,因此如何提高、获取热稳定性木聚糖酶是当前研究的热点。海栖热袍菌GH12家族葡聚糖酶Cel12B（17号）,其最适反应温度100℃,是一种极耐热酶,且底物特异性不强,也能作用于木聚糖底物。三维结构预测和分析,发现与GH11木聚糖酶结构十分相似,但是17号没有GH11酶的高度保守结构“Thumb”,另外17号酶有一较大的无规则卷曲。这两个结构差异可能与GH12和GH11酶的底物特异性有关。实验室前期得到黑曲霉木聚糖酶（23号）,属于GH11家族。故拟将23号酶中的Thumb结构引入17号酶,同时去除17号酶中较大的无规则卷曲,以期得到热稳定性木聚糖酶。本论文研究并获得以下结论:（1）密码子优化提高蛋白表达量。17号酶在大肠杆菌中的表达量很低,研究发现,17号酶翻译起始端的mRNA二级结构,可能是造成该酶表达量低的主要原因。因此,设计并定点突变了17号酶翻译起始端mRNA的密码子,优化后酶17_OPT的表达量提高6.37倍,单位发酵液酶活提升4倍。蛋白电泳图谱的灰度扫描显示,优化密码子后酶的大量表达形成了大量的包涵体蛋白。（2）高密度自诱导培养基提高酶表达量。常规的LB+IPTG的蛋白诱导表达方法表达量较低,本研究使用自诱导培养基ZYM-5052进行高密度低温诱导,使发酵液的菌体密度提高2.21倍,酶活提高7.33倍,可溶蛋白比例从50.85%提高至72.08%。（3）利用反向PCR方法,构建了引入Thumb结构(17_OPT-Thu)、去除主要结构(17_OPT-R)和去除主要结构并引入Thumb结构(17_OPT-Thu-R)三种突变体酶,其中17_OPT-R和17_OPT-Thu-R全部形成包涵体。Thumb结构引入对17号酶酶学性质影响:本文以两种底物CMC（Carboxymethyl cellulose-sodium,羧甲基纤维素钠盐）和BWX（Beech wood xylan,山毛榉木聚糖）来研究酶学性质。（1）17_OPT和17_OPT-Thu的最适pH和最适温度相同,对CMC底物pH_opt为4.8,对BWX底物pH_opt为5.6,T_opt为100℃,表明Thumb结构没有改变酶的最适反应条件。热稳定性检测表明17_OPT-Thu酶100℃下保温3h后,残余酶活仍达到95%以上,很好地保留了野生型酶的极耐热特性。（2）纯酶动力学参数测定:引入Thumb结构后,K_m（CMC）从5.6mg/ml提高到7.1mg/ml,K_m（BWX）从1.3mg/ml提高至2.2mg/ml,K_cat（CMC）从494.3s^-1下降至174.3s^-1,K_cat（BWX）从4.3s^-1下降至2.8s^-1。Thumb结构的引入没有达到预期效果,与两种底物的亲和能力和酶的催化能力都有所下降。（3）HPLC产物检测实验结果表明,引入Thumb结构前后,酶对CMC底物作用后的产物几乎没有发生变化,但是引入Thumb后酶对BWX底物作用的产物中木二糖、木三糖和木四糖的比例有所增加,显示了Thumb结构参与了酶对BWX的催化过程,产生了更多的低聚寡糖。（4）最后对酶和底物进行分子对接分析,发现Thumb结构的引入对酶与两种底物的影响有很大不同。对于纤维四糖底物来说,引入Thumb前后酶与底物相互作用的改变不利于酶的催化活性。对于木四糖底物来说,引入Thumb结构后,17_OPT-Thu与底物形成疏水作用的氨基酸没有发生太大改变,但是17_OPT-Thu中Glu131,Met142,Tyr187,Glu235,Glu239与底物形成5个氢键,增强了酶与底物的结合。这种变化使酶与底物催化时结合更加紧密。解释了酶的动力学实验和HPLC产物测定实验的结果。