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研究背景:皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是常见的皮肤恶性肿瘤之一,发病率高,具有一定的侵袭及转移能力,严重影响患者生活质量。常见发病危险因素为紫外线(UV)辐射、病毒感染、机体免疫状态等。目前治疗方法有手术切除、激光和冷冻治疗、放射治疗及药物治疗等,但部分患者疗效欠佳。NAD(P)H脱氢酶1(NQO1)是一种器官中广泛分布的黄素酶,以NAD(P)H为供体,催化醌类化合物的双电子还原为对苯二酚类化合物。据报道,NQO1基因缺失,易使小鼠受到氧化应激的影响,发展为肿瘤。也有报道称NQO1敲除可减少胶质母细胞瘤细胞的增殖,而过度表达则增加细胞增殖。基于上述不同的观点,NQO1被认为同时具有抗癌和致癌作用,这取决于不同的条件和细胞种类。由于皮肤鳞状细胞癌的发生发展与紫外线诱导的氧化应激密切相关,我们推测NQO1可能在鳞状细胞癌中起作用。阿苯达唑是一种驱虫药,但近期研究表明阿苯达唑具有抗肿瘤(如非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤等)活性,但阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞的作用及其作用机制的影响尚不清楚。因此,本文拟对NQO1基因及阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭迁移的影响及机制进行研究,进一步揭示皮肤鳞状细胞癌的发生机制,为阿苯达唑临床应用奠定理论基础。第一部分NQO1对皮肤鳞状细胞癌增殖侵袭转移的影响及机制研究目的:检测NQO1基因对皮肤鳞状细胞癌增殖、侵袭迁移的影响,并探讨其机制,为研究鳞癌的发病机制和寻求有效诊断治疗靶点提供新的思路。方法:1.NQO1表达水平检测收集皮肤鳞状细胞癌患者肿瘤组织及肿瘤周围正常组织,进行免疫组化染色,评估鳞癌组织及正常皮肤组织中NQO1表达水平;用western blot方法检测人皮肤细胞如表皮角质形成细胞、人皮肤成纤维细胞以及鳞癌细胞SCC12和SCC13中NQO1蛋白表达水平。2.重组腺病毒的构建通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等获得NQO1基因过表达或敲除的重组腺病毒。3.NQO1过表达或敲除对皮肤鳞癌细胞生物学行为的影响细胞生长实验用于评估NQO1对CSCC增殖的影响;平板克隆形成实验用于评估NQO1以及阿苯达唑对CSCC细胞平板克隆形成能力的影响;细胞侵袭实验和Wound-healing细胞划痕实验检测对CSCC细胞迁移侵袭能力的影响;4.机制研究western blot方法检测NQO1过表达或敲除对细胞增殖相关调节蛋白如Cyclin D1、Cyclin E、SOX2等表达影响,对E-cadherin、snail等EMT相关分子标志影响,以及EMT相关信号通路标志性分子如AKT、JNK和p38 MAPK等的磷酸化水平的影响,从而揭示NQO1对CSCC增殖、侵袭迁移影响的机制:用深红色染料检测细胞内ROS水平,用于评估NQO1对细胞内ROS水平的影响。结果:1.NQO1在皮肤鳞状细胞癌中的表达NQO1在CSCC损伤区几乎没有检测到或部分检测到。在CSCC病变周围的免疫细胞中可观察到NQO1免疫反应性。与角质形成细胞和成纤维细胞相比,皮肤鳞状细胞癌细胞(SCC12和SCC13)和皮肤细胞中NQO1蛋白水平略低。2.NQO1过表达或敲除对皮肤鳞癌细胞生物学行为的影响细胞生长实验:NQO1过表达导致CSCC细胞系(SCC12和SCC13细胞)细胞增殖显著降低,而NQO1敲除则增加了细胞增殖;与细胞增殖实验结果相似,NQO1降低了SCC12和SCC13细胞的克隆形成活性;细胞侵袭实验:NQO1过表达显著降低了SCC细胞侵袭能力,而NQO1敲除增加了CSCC细胞侵袭;Woundhealing细胞划痕实验:NQO1过表达减少细胞迁移,而NQO1敲除增加细胞迁移。3.NQO1对CSCC细胞增殖相关调节因子的影响NQO1过表达显著降低了细胞增殖相关调节因子如Cyclin D1、Cyclin E等的水平,NQO1敲除增加了这些细胞增殖相关调节因子的水平。4.NQO1对上皮-间质转化(EMT)相关分子标记的影响NQO1过表达使CSCC细胞E-cadherin水平升高,N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug水平略有下降,而NQO1敲除略微降低了CSCC细胞E-cadherin的水平,而增加了其他分子的水平。5.NQO1对上皮-间质转化(EMT)相关细胞内信号通路的影响NQO1过表达轻微地降低了CSCC细胞磷酸化AKT、JNK和p38MAPK的水平,而NQO1敲除则增加了磷酸化AKT、JNK和p38MAPK的水平。6.NQO1对CSCC细胞内ROS水平的影响NQO1过表达明显降低了CSCC细胞内ROS水平,NQO1的敲除导致了CSCC细胞内ROS水平显著升高。结论:NQO1可抑制CSCC增殖、侵袭迁移;NQO1抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖可能与调节增殖相关调节蛋白如细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白E(CyclinE)及p63等水平有关;NQO1可抑制CSCC细胞的侵袭迁移,其机制可能与调控E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、Snail、slug等上皮间质转化(EMT)相关分子标记的表达水平有关;NQO1对皮肤鳞状细胞癌上皮-间质转化(EMT)的影响与降低EMT相关细胞内信号通路中AKT、JNK和p38mapk等的磷酸化水平有关;NQO1可降低CSCC细胞内ROS的水平。第二部分阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤作用及机制研究目的:研究阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤作用及机制。方法:1.通过MTT实验评估阿苯达唑对CSCC细胞的细胞毒性及凋亡的影响。2.通过TUNEL染色及Western blot检测阿苯达唑对CSCC细胞凋亡的影响。3.机制研究通过TOPflash实验检测阿苯达唑对CSCC细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响;Westernblot及MTT实验检测阿苯达唑对内质网应激的影响;平板克隆形成实验、MTT实验及Western blot方法检测阿苯达唑对CSCC干细胞特性的影响。结果:1.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响MTT实验显示,在阿苯达唑浓度大于等于0.2μm时可降低SCC12和SCC13细胞的生存能力;Tunel检测显示,与DMSO处理对照组相比,阿苯达唑处理组超过浓度大于等于0.5μm时凋亡细胞明显增加;Western blot示阿苯达唑诱导CSCC细胞凋亡且呈剂量依赖性。2.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的特异性作用使用正常的人表皮角质形成细胞进行对比试验显示,阿苯达唑剂量超过0.2μM时可诱导SCC13细胞凋亡,而在阿苯达唑剂量超过1.0μM仍未能诱导人表皮角质形成细胞凋亡。3.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞内质网应激的影响阿苯达唑增加了SCC12和SCC13细胞内质网应激诱导凋亡相关信号分子半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-12水平。内质网应激抑制剂4-PBA预处理抑制了阿苯达唑诱导的CHOP和半胱天冬酶-12的活化。4.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞干细胞特性的影响阿苯达唑在无毒剂量0.05μM和0.1μM时能显著降低SCC12和SCC13细胞的克隆形成能力,导致TOPflash活性降低;这些数据一致,Western blot显示阿苯达唑处理使Wnt/β-连环蛋白明显减少。结论:阿苯达唑可诱导皮肤鳞状细胞癌细胞的凋亡;阿苯达唑诱导CSCC细胞凋亡具有特异性;阿苯达唑诱导CSCC细胞内质网应激;阿苯达唑能作用于Wnt/β-连环蛋白信号通路,降低CSCC的干细胞特性。