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目的由于世界人口老龄化速度不断加速,阿尔兹海默症(AD)、帕金森综合征(PD)等神经系统退行性疾病(DDNS)已成为危害老年人群生命健康的重要疾患,因此加快推进神经系统衰老生物学和相关疾病防治意义重大。课题组前期工作证明,神经退行性疾病的发生发展与神经干细胞(NSCs,neural stem cells)的衰老和功能的退化有着密不可分的联系。通过干预细胞氧化应激损伤过程可以显著延缓NSCs衰老,并减少神经退行性疾病的相应临床症状,但机制尚不明确。被冠以“百草之王”美誉的人参在祖国传统医学领域里一直以来被视为“补气”要药,而作为其皂苷成分之一的Rg1则在人参中发挥着抗衰老的功能。课题组既往研究表明,人参皂苷Rg1有显著抵抗NSCs老化的功效,能改善脑衰老动物的神经退行性症状,其机制有待深入探讨。最新理论认为Nrf2/ARE信号通路在干细胞对抗氧化应激损伤中起着十分关键的作用,细胞核相关因子2(Nrf2)可通过与抗氧化反应元件(ARE)增强抗氧化基因的表达,进而调控细胞的抗氧化应激和氧化还原反应。最新研究证明,老年机体NSCs衰老可能与该通路的阻滞或部分阻滞有关。迄今未见Rg1延缓NSCs衰老和调控Nrf2/ARE信号通路关系的报到,如果能寻找到Rg1调控NSCs衰老的靶点将有重要理论意义和临床应用价值。本实验利用D-半乳糖(D-gal)作致衰剂模拟自然衰老在体外构建NSCs实验模型,用以探究人参皂苷Rg1延缓NSCs衰老与Nrf2/ARE信号通路之间的关系,目的是为探索延缓NSCs衰老靶点提供实验和理论基础。方法剥离新生小鼠全脑并培育NSCs至P3代,可构建细胞衰老模型,并加入Rg1干预,检测各相应指标。1.将出生1d内的乳鼠剥离全脑,在冰面上剪碎全脑,随后加入胰蛋白酶用巴氏管轻轻吹打消化5min后,1000r/min离心5min后弃上清液。在避光条件下,每个细胞培养瓶加入3m LNSCs完全培养基,在37℃、CO2浓度5%的培养箱中孵育2d之后收集聚合成球的NSCs,并使用胰蛋白酶将NSCs球消化分解成独个NSCs然后继续培养。这个过程需要重复多次,当NSCs培育至P3代时,进行后续实验。2.将NSCs以5×105/m L接种至细胞培养瓶分为四组。D-gal组(衰老模型组)添加终浓度10g/L的D-gal共同培育48h;Rg1组,先常规培育24h,再添加终浓度20ug/m L的Rg1共同培育24h;空白对照组,直接常规培育48 h;D-gal+Rg1组(Rg1抗衰老模型组)先添加终浓度10g/L的D-gal培育24h,再添加终浓度20ug/m L的Rg1培育24h。实验模型构建结束后,第2d可开展相应后续实验设计。3.3.免疫荧光检测各组NSCs巢蛋白表达。4.CCK-8法检测NSCs增殖情况,酶标光密度测神经球的增殖情况。5.SA-β-gal染色检测NSCs,根据染色阳性细胞数与百分率评价细胞衰老情况。评价细胞存活率。6.台盼蓝染色检测NSCs,根据着色阳性细胞数与百分率7.酶标比色法检测NSCs培养上清液中氧化应激相关指标SOD、MDA、CAT、4-HNE和8-OHd G含量,评价细胞衰老情况。8.荧光定量PCR检测NSCs中Nrf2/ARE信号通路相关基因GCLC、GCLM、NQO1和GSTM-1表达水平,评价NSCs衰老与Nrf2/ARE通路激活或阻滞的关系。9.Western-blot检测NSCs中Nrf2/ARE信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1和Keap1表达水平,评价NSCs衰老与Nrf2/ARE通路的关键靶点。结果1.观察NSCs生长状况:Rg1组与空白对照组比较,形成的神经球总体较规则且总量明显增加。D-gal组形成的神经球总体大小不一,且神经球总量下降。D-gal+Rg1组相较于D-gal组其形成的神经球球体大小较为规整,总量有所增加。2.利用免疫荧光鉴定各组巢蛋白表达情况,结果表明,4组神经球均呈现巢蛋白阳性表达。3.CCK-8法检测NSCs增殖情况,实验结果表明:D-gal组相较于空白对照组增殖受到明显抑制,而Rg1组相较于D-gal+Rg1组其增殖情况得到显著改善。4.SA-β-gal染色各组神经球证明,相较于空白对照组,D-gal组神经球阳性百分率明显升高,Rg1组相比于D-gal+Rg1组神经干细胞球阳性百分率下降明显。5.台盼蓝染色检测各组NSCs证明,在培养体系中加入D-gal共培养组相比于空白对照组,NSCs存活率下降。体外加入Rg1共培养组和D-gal+Rg1组与相应对照组相比,NSCs存活率显著上升。6.氧化应激指标检测各组NSCs培养液证明,D-gal组相较于空白对照组上清液中SOD和CAT活性显著下降;MDA、4-HNE和8-OHd G含量明显上升。体外培养加入Rg1共培养组和D-gal+Rg1组与相应对照组相比,培养上清液中各指标下降明显。7.荧光定量PCR检测各组NSCs中Nrf2/ARE通路相关基因的表达,结果表明:加入D-gal共培养组相比于空白对照组,NSCs中此通路相关抗氧化基因表达水平降低。Rg1组和D-gal+Rg1组相比Nrf2/ARE通路相关基因表达量有所升高。8.Western-blot检测各组NSCs中Nrf2/ARE通路相关蛋白的含量,结果表明:D-gal组相比于空白对照组NSCs中Nrf2/ARE通路相关蛋白含量下降。Rg1组与D-gal+Rg1组与相应对照组相比Nrf2/ARE通路相关蛋白含量升高。结论1.利用致衰剂D-gal能在体外成功构建NSCs衰老模型。2.人参皂苷Rg1能拮抗D-gal对NSCs致衰作用的影响。3.人参皂苷Rg1抵抗D-gal对NSCs的致衰作用与降低细胞氧化应激损伤有关。4.人参皂苷Rg1拮抗D-gal所致的NSCs衰老的可能机制与调控Nrf2/ARE通路关键靶点有关。