目的：　　 肾细胞癌约占成人恶性肿瘤的3％，发病时约30%病例为晚期。由于肾癌细胞高度表达耐药基因，故对常规的化疗无效。晚期肾癌的治疗以免疫治疗为主，但有效率仅10%左右。近年来开发的新型分子靶向药物如舒尼替尼和索拉菲尼等，使得晚期肾癌的疗效有了一定提高，但由于价格昂贵，多数患者难以负担。因此，有必要寻找高效低毒，且价格相对低廉的新型抗肿瘤药物，以进一步提高晚期肾癌的疗效。　　 Bufalin和榄香烯(elemene)是从中药中提取的抗癌有效成分，可抑制多种肿瘤细胞(如肺癌、结肠癌和胶质瘤)的增殖。但关于它们对肾癌有无抗肿瘤作用目前尚不清楚。硼替佐米(bortezomib，PS-341)是一种新型蛋白酶体抑制剂，已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗。小样本临床研究结果提示硼替佐米对转移性肾细胞癌有效，但其具体抗肿瘤作用及机制需要进一步研究。　　 细胞内调节增殖及凋亡的信号通路主要有核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路和PI3K/Akt/mTOR通路等。这些信号传导通路的活性对药物的抗肿瘤作用具有重要的影响，抗癌药物可通过改变这些通路的活性抑制细胞增殖，诱导凋亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，位于Akt的下游，能激活p70S6K1等来增强mRNA的转录和翻译，进而增加一系列细胞生长相关蛋白的表达，引起细胞快速增殖。目前NCCN指南推荐的用于治疗转移性肾癌的药物中有两种是mTOR抑制剂，可见mTOR是治疗肾癌的重要靶点。mTOR还是自噬的负性调控因子，抑制mTOR活性可诱导自噬发生。研究表明一些抗肿瘤药物在诱导细胞凋亡的同时可激活自噬反应，抑制自噬可增强药物的抗肿瘤作用。目前药物诱导的保护性自噬已成为肿瘤耐药的研究热点。　　 本研究以肾透明细胞癌786-0细胞为模型，探讨新型抗肿瘤药物bufalin，β-榄香烯和PS-341对786-0细胞活力，凋亡及周期分布的影响，并进一步研究药物对细胞内NF-κB、MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路活性的影响，以及对自噬的影响，以寻找治疗肾癌的有效药物。　　 材料与方法：　　 1.采用MTT方法测定细胞活力，绘制生存曲线。　　 2.采用流式细胞术PI染色进行细胞凋亡及细胞周期检测。　　 3.采用Western blot法检测蛋白的表达。　　 4.采用透射电镜技术观察自噬的形态学变化。　　 5.统计学分析：数据以均数±标准差表示。两组间差异采用Students ttest分析。P<0.05认为有统计学意义。　　 实验结果　　 一、Bufalin、β-榄香烯和PS-341对肾细胞癌的抗肿瘤作用　　 (一)传统化疗药物及生物制剂对786-0细胞活力的影响　　 不同浓度的阿霉素(ADM)、顺铂(CDDP)作用于786-0细胞24 h，氟尿嘧啶(5-FU)作用于786-0细胞48 h，细胞活力仅轻度受抑制。与此类似，不同浓度的TNF和IL-2处理细胞24或48 h，细胞活力无明显变化。　　 (二)Bufalin、β-榄香烯及PS-341对786-0细胞活力的影响　　 不同浓度的bufalin作用于786-0细胞24、48和72 h，抑制细胞50%的药物浓度(IC50)分别为77.62 nmol/L、24.46 nmol/L和14.43 nmol/L；β-榄香烯在24、48和72 h的IC50分别为145.60μg/mL，126.90μg/mL和63.84μg/mL；PS-341作用24 h细胞活力无明显变化，48和72 h的IC50分别为55.17 nmol/L和19.93 nmol/L。这些数据提示bufalin，β-榄香烯和PS-341对肾癌786-0细胞有明显的增殖抑制作用。　　 (三)Bufalin、β-榄香烯及PS-341对786-0细胞凋亡及周期分布的影响　　 流式细胞分析术结果显示，bufalin和β-榄香烯作用786-0细胞24h后，凋亡细胞百分比明显升高，与正常对照组相比P直均<0.05；G2/M期细胞比例无明显变化。PS-341作用于细胞24或48 h，凋亡细胞百分比无明显变化，而G2/M期细胞比例明显升高，P<0.05。　　 (四)Bufalin、β-榄香烯及PS-341对786-0细胞凋亡相关蛋白表达的影响　　 80 nmol/L的bufalin作用786-0细胞24 h，PARP明显裂解，Bax/Bcl-2比值升高；150μg/mL的β-榄香烯作用细胞24 h后也可见PARP裂解，Bcl-2及Survivin蛋白表达下降，Bax表达无明显变化；50 nmol/L的PS-341作用细胞24和48 h，PARP仅轻度裂解，Bcl-2、Bax表达无明显变化，Survivin表达升高。　　 二、Bufalin、β-榄香烯和PS-341对细胞内信号传导通路的影响　　 (一)Bufalin、β-榄香烯和PS-341对786-0细胞NF-κB通路活性的影响　　 Bufalin、β-榄香烯作用786-0细胞不同时间，IκBα蛋白表达水平无明显变化，而PS-341作用后IKBa表达逐渐增加，提示bufalin和β-榄香烯对NF-κB通路活性无影响，而PS-341可抑制NF-KB通路活性。　　 (二)Bufalin、β-榄香烯和PS-341对ERK及JNK通路活性的影响　　 Bufalin、β-榄香烯和PS-341均可一过性活化ERK通路，其中β-榄香烯和PS-341作用后ERK活性逐渐下调，之后低于正常水平，而bufalin对ERK活性无明显抑制作用。Bufalin和β-榄香烯均可一过性活化JNK通路，而PS-341作用至24-48 h才明显活化JNK通路。这些结果提示，ERK及JNK通路参与了三种药物对786-0细胞的抗肿瘤过程。　　 (三)Bufalin、β-榄香烯和PS-341对786-0细胞PI3K/Akt/mTOR通路活性的影响　　 Bufalin、β-榄香烯和PS-341作用细胞后，p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K1水平逐渐下降，至24或48 h明显低与正常对照细胞，提示三种药物通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性发挥对肾癌细胞的抗肿瘤作用。　　 三、药物诱导的保护性自噬拮抗对肾癌细胞的抗肿瘤作用　　 (一)Bufalin、β-榄香烯和PS-341对LC3蛋白表达的影响　　 Bufalin、β-榄香烯和PS-341作用786-0细胞24 h后，LC3-Ⅱ的表达水平明显升高，LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值升高，提示自噬反应发生。　　 (二)Bufalin、β-榄香烯和PS-341诱导自噬小体形成　　 Bufalin、β-榄香烯和PS-341作用细胞24 h，电镜下可观察到自噬小体，表现为细胞内的双层膜小泡明显增多，泡内可见被吞噬的细胞内容物，此为自噬的典型形态学变化，提示药物作用后可诱导自噬反应发生。　　 (三)抑制自噬对药物抗肿瘤活性的影响　　 自噬抑制剂3MA或氯喹(CQ)预处理细胞1 h，再加入bufalin、β-榄香烯或PS-341继续作用24或48 h，同药物单独处理组相比，加入自噬抑制剂可明显降低细胞活力，提示抑制自噬可增强药物的抗肿瘤活性。　　 结论　　 1.786-0细胞对传统化疗药物及生物制剂耐药，而新型抗肿瘤药物bufalin、β-榄香烯和PS-341对细胞有明显的增殖抑制作用。　　 2.Bufalin和β-榄香烯通过下调抗凋亡蛋白的表达诱导786-0细胞凋亡；PS-341主要诱导细胞发生G2/M期阻滞，对凋亡无明显影响。　　 3.Bufalin、β-榄香烯和PS-341通过影响ERK和JNK通路活性，发挥对细胞的抗肿瘤作用；Bufalin和β-榄香烯对NF-κB通路活性无明显影响，而PS-341可抑制NF-κB通路活性；Bufalin、β-榄香烯和PS-341均可抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性。　　 4.Bufalin、β-榄香烯和PS-341可诱导自噬反应，抑制自噬可增强药物的抗肿瘤活性，提示药物诱导保护性自噬拮抗其抗肿瘤作用。