原发性胆囊癌（primary carcinoma of the gallbladder,PCG）是胆道系统常见的恶性肿瘤,居消化道肿瘤的第5～6位。PCG患者常有胆囊结石等疾病的掩盖，早期诊断率仅为9.1%，就诊时往往已到晚期，失去手术机会，而传统的化疗和放疗疗效不明显，因此PCG患者5年生存率仅为4.9%。随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学等相关学科的迅速发展，肿瘤的免疫治疗已成为继传统治疗方法如手术、放疗和化疗后的一种新的治疗方法。为了发挥肿瘤免疫治疗的最佳疗效，人们有必要对影响免疫治疗效果的肿瘤免疫耐受机制有一个清楚而全面的认识。研究表明吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1)介导的肿瘤免疫耐受已成为研究热点。在多种肿瘤组织中有高表达，通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度来抑制淋巴细胞的增殖。而吲哚胺2，3-双加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase2,IDO2)，为最近研究发现的一种与IDO1结构相似的蛋白，推测其在肿瘤免疫耐受形成中也起着重要的作用。那么IDO1和IDO2在胆囊癌组织中表达情况如何？在免疫耐受形成中各起什么作用？目前尚未有文献报道，本课题进行了以下两方面的研究：一、IDO1与叉状头转录因子3(Forkhead box P3，FOXP3)在胆囊癌组织中的表达情况及临床意义探讨；二、IDO1，IDO2在胆囊癌细胞中的表达及在免疫耐受中作用的机制研究。论文一IDO1和FOXP3在胆囊癌组织中的表达及临床意义探讨IDO1是一种细胞内含亚铁血红素的酶,通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚环,从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢，IDO1在肿瘤免疫耐受中起到重要作用。当肿瘤抗原刺激巨噬细胞和树突状细胞后,就会通过产生IDO1来改变微环境内色氨酸及其代谢产物的局部浓度来抑制淋巴细胞的肿瘤抗原特异性克隆增殖,而肿瘤细胞在IFN-γ刺激下产生的IDO1也能够使其免受机体的免疫系统攻击。FOXP3被认为是调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的特异性标志，Tregs能以自分泌的形式分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子，抑制抗原特异性的CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞和自然杀伤细胞的功能。IDO1和Tregs之间存在着调节环路。可相互作用促进彼此的表达，在多种肿瘤中有高表达，推测其两者在胆囊癌组织中也呈高表达。目的研究IDO1、FOXP3在原发性胆囊癌组织中的表达情况及临床意义的探讨方法采用免疫组化SP法检测51例原发性胆囊癌组织、90例慢性胆囊炎组织和20例正常胆囊组织中IDO1和FOXP3的表达情况。结果1. IDO1在胆囊癌、胆囊炎、胆囊结石组和正常对照组胆囊粘膜中的表达率分别为72.5%(37/51)、11.1%(10/90)和5.0%(1/20),淋巴细胞中FOXP3的表达率分别为60.8%(31/51)、32.2%(29/90)和20.0%(4/20),IDO1和FOXP3在胆囊癌与慢性胆囊炎、胆囊结石组、正常对照组中的阳性率比较,差异均有统计学意义(IDO1:X2=65.44,P<0.01;FOXP3: X2=14.81,P<0.01)；2.胆囊癌在Nevin不同分期、有无淋巴结或远处转移、有无伴发胆囊结石组间的IDO1和FOXP3的阳性率表达差异均有统计学意义(P均<0.05),而不同性别、年龄、组织学分化程度间IDO1和FOXP3的阳性率表达差异均无统计学意义(P均>0.05)；3.胆囊癌组织中IDO1阳性表达率69.8%与FOXP3阳性表达率58.1%之间存在显著正相关(r=0.406,P=0.003)。结论IDO1和FOXP3二者可能以协同作用形式参与了胆囊癌免疫耐受的形成，IDO1可能成为胆囊癌免疫治疗的新靶点。论文二IDO1和IDO2在胆囊癌细胞免疫耐受形成中的作用机制研究IDO1是一种细胞内含亚铁血红素的酶通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚环,从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢。IDO1在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用，因此,目前认为IDO1的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因素之一。最近研究发现,有一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与IDO1十分相似的物质，它被命名为IDO2，发现抑制IDO2比抑制IDO1在抑制肿瘤生长方面更有效果。推测其在免疫耐受中也起到重要作用。因IDO2为近几年才发现的色氨酸分解酶，所以前期研究的IDO现在被称为IDO1.目的探讨IDO1、IDO2在胆囊癌细胞株SGC-996中的表达及在免疫耐受形成中的作用方法1.用免疫印记法及免疫荧光检测不同浓度IFN-γ刺激人胆囊癌细胞SCG-996后IDO1、IDO2的表达情况；2.用RNA干扰分别沉默胆囊癌细胞株SGC-996中IDO1、IDO2蛋白的表达，用免疫印记法检测沉默效果；3.高效液相色谱法（HPLC）检测分别干扰IDO1、IDO2后培养基中犬尿酸的变化，进而评估IDO酶活性的变化。4.用人外周血淋巴细胞与SGC-996分别干扰IDO1、IDO2培养基共培养24h后，收集外周血淋巴细胞，Annexin V/PI双标记检测人外周血淋巴细胞凋亡。结果1. Western blot检测结果显示，随着IFN-γ加入浓度由低到高，胆囊癌细胞株SGC-996中IDO1表达与IFN-γ成剂量依赖的关系；在无IFN-γ刺激下无表达，随着IFN-γ浓度的增加表达也增多。IDO2无论在有无IFN-γ，或IFN-γ浓度高低，呈都恒定表达。2.共聚焦显微镜在检测IDO1时，无IFN-γ时，IDO1含量很低，在有IFN-γ刺激时，IDO1表达增加，IDO1定位于细胞浆中。而IDO2却恒定表达，不受IFN-γ的影响，定位于胞浆和细胞核内。3. HPLC发现无IFN-γ刺激和沉默IDO1时，培养基中犬尿氨酸浓度几乎为零，而在沉默IDO2、CTL、Mock组中犬尿酸的浓度明显增加。沉默IDO1组和沉默IDO2、CTL、Mock组之间差异有统计学意义（p＜0.01），表明IDO1和IDO2同时在IDO酶催化色氨酸分解为犬尿氨酸的过程中，IDO1起主要作用。4.流式细胞仪分析不同的条件培养基与人外周血淋巴细胞培养1天后，在阴性组、IDO1沉默组、IDO2沉默组死亡率分别为0.8%、1.1%、1.9%，而在阳性对照组中晚期凋亡及死亡细胞增多，分别为15.4%、12.4%、13.6%。IDO1沉默组、IDO2沉默组与阳性对照组差异有统计学意义。结论：IDO1在IDO酶催化活性中起主要作用，抑制胆囊癌细胞中IDO1或IDO2的活性可减少淋巴细胞死亡，为研究IDO1、IDO2在免疫耐受形成中的作用提供依据。