研究背景干燥综合征(primary Sjogren Syndrome, pSS)是一种常见的慢性自身免疫性疾病,其特征性改变为外分泌腺体被B淋巴细胞浸润,如主要影响泪腺和唾液腺,从而引起口干、眼干症状。该病可为原发性、继发性,继发性为继发于其他系统性自身免疫性疾病如类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)。干燥综合征表现复杂、多样,可以表现为仅累计外分泌腺,也可以表现为多系统受累的自身免疫性疾病。pSS表现为多克隆B细胞活化,继之引起p2微球蛋白升高和大量自身抗体产生。pSS发病机制涉及多个因素,包括病毒感染、激素平衡及遗传背景。T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞与疾病活动程度相关。本病中异常细胞因子的产生已经引起相当大的关注。颗粒蛋白前体(Progranulin, PGRN)也称之为颗粒蛋白-上皮素前体(granulin-epithelin precursor, GEP),上皮素前体(proepithelin),前列腺癌细胞衍生生长因子(prostatic cancer-cell derived growth factor, PCDGF)等,是一种具有多种生物学功能的自分泌因子,由颗粒体蛋白(granulin, GRN)基因编码。PGRN大量表达于神经元,淋巴细胞,增殖活跃的上皮细胞和软骨细胞及免疫细胞中。此外,在人的多种肿瘤细胞中也发现了PGRN的高水平表达。大量研究发现,PGRN在许多生理性和病理性过程中发挥着关键性的作用。例如胚胎的早期发育,炎症反应,创伤愈合和组织重构,免疫反应等。诸多研究也发现PGRN与乳腺癌,卵巢癌以及多发性骨髓瘤等多种肿瘤的发病有关。也有研究发现PGRN基因变异可引起的PGRN蛋白表达部分丢失,导致额颞叶痴呆,故而PGRN也是一个重要的神经营养因子。此外PGRN也参与了软骨发育和降解,Tang W等报道PGRN可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体结合,阻断TNF-a的信号转导,拮抗关节炎小鼠模型的关节炎症反应。Qiufeng等发现SLE患者PGRN表达升高,糖皮质激素治疗后PGRN表达下降。因此,PGRN可能是未来治疗自身免疫性疾病的新靶点。然而,PGRN在pSS患者中的表达至今未有报道。基于上述观点,我们在此项研究中检测了pSS患者及健康对照人群外周血中PGRN, IL-6的表达浓度及mRNA的表达水平,以探讨PGRN在pSS患者中的作用及其与疾病活动性的关系。此外,还观察了糖皮质激素对PGRN表达水平的影响。研究方法：1.研究对象筛选26例新诊断的pSS患者进入实验组,他们全部符合2002年修订的pSS国际诊断(分类)标准。所有患者入组前都未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂的治疗,并在用药前采集第一次外周血样。入组后所有患者均接受了糖皮质激素治疗(泼尼松10mg/day)及对症支持治疗。连续给予泼尼松3周后再次采集外周血样。选取26例性别年龄匹配的来我院查体的健康人进入对照组。所有研究对象均签署了山东大学齐鲁医院临床伦理委员会的知情同意书。2.酶联免疫吸附试验检测外周血清细胞因子的浓度在实验组pSS患者接受泼尼松治疗前后分别收集5ml外周自凝血,凝固后离心分离出血清,储存在-80℃条件下。按照说明书用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测血清中PGRN, IL-6, ANA, SSA, SSB抗体的血清浓度。3.实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析各细胞因子mRNA的表达在实验组pSS患者接受泼尼松治疗的前后分别收集5m1外周抗凝血,用红细胞裂解液提取外周血中的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PMBC),根据说明书用Trizol法提取PMBCs的总RNA。核酸蛋白测定仪初步测定RNA的浓度并标准化至1ug/ml以利于接下来的反转录步骤。用反转录试剂盒获取cDNA后进行实时定量PCR检测PMBCs中PGRN、IL-6的mRNA的表达水平。4.免疫印迹(Western Blot)分析外周血PGRN蛋白水平对照组和实验组pSS患者接受泼尼松治疗的前后分别收集5ml外周抗凝血,用红细胞裂解液提取外周血中的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PMBC),然后提取细胞总蛋白,采用Western Blot方法检测外周血PGRN蛋白的表达。5.统计分析用SPSS17.0软件进行结果的统计分析。数据用中位数±四分位距表示。PGRN的分布为非正态分布,采用非参数检验。糖皮质激素治疗前组和治疗后组数据的分析采用两个相关样本的非参数检验。实验组和对照组之间的数据分析采用两个独立样本的非参数检验.PGRN与IL-6之间的关系用斯皮尔曼等级相关进行分析。认为P<0.05差异具有统计学意义。研究结果1.研究对象的临床特点实验组的26例pSS患者中,女性25例,男性1例,年龄24-65岁,平均44.8±10.96岁。病程2-98月,平均20.4±22.0个月。对照组包括女性23例,男性3例,年龄在23-65岁之间,平均32.3岁。pSS患者临床特点如表2所示。2.pSS患者外周血清中PGRN水平升高治疗前pSS患者外周血清中PGRN、IL-6的浓度均高于正常对照组PGRN (14.57±7.93vs9.80±5.67,p<0.05),IL-6(1.81±1.03vs0.84±0.69, p<0.05).治疗后pSS患者与治疗前pSS组相比,外周血清中PGRN浓度显著下降(10.39±7.47vs14.57±7.93,p<0.05)。但治疗后pSS患者外周血清中PGRN浓度显著仍高于健康对照组(10.39±7.47vs9.80±5.67,p<0.05)。总之,无论是治疗前还是治疗后pSS患者外周血清中PGRN的表达均高于正常对照人群。治疗前pSS患者外周血清中IL-6(1.81±1.03vs0.84±0.69,p<0.05)水平高于健康对照组,也高于激素治疗后pSS患者IL-6水平(1.81±1.03vs1.05±0.79,p<0.05)。3.pSS患者PMBCs中PGRN mRNA和蛋白高表达我们用与内参基因GAPDH匕较后的倍数表示PGRN mRNA表达水平的变化。如图1A所示,与健康对照组相比,激素治疗前pSS患者PGRN mRNA表达相对数值升高了3.45倍(P<0.05)。激素治疗后pSS患者与健康对照组相比,PGRN mRNA表达相对数量仅升高了1.6倍(P<0.05)。并且激素治疗前和治疗后pSS患者PGRN mRNA的表达也有显著差异(P<0.05)。治疗前pSS患者外周血PGRN蛋白水平高于健康对照组(P<0.05)。治疗后pSS患者与治疗前pSS患者组相比,外周血中PGRN蛋白水平下降(P<0.05)。3.激素治疗下调pSS患者的PGRN、IL-6的表达水平在实验组中,经过GC治疗后,外周血清中PGRN(10.39±7.47vs14.57±7.93,P<0.05), IL-6(1.05±0.79vs1.81±1.03, P<0.05)的浓度明显下降。治疗后pSS患者与治疗前相比,PGRN mRNA和蛋白表达相亦明显下降(P<0.05)。5.pSS患者PGRN与IL-6的关系为了明确在pSS患者中PGRN表达水平与炎症反应因子之间的关系,我们用斯皮尔曼等级相关分析了PGRN与IL-6之间的相关性。结果显示,治疗前的SLE患者外周血清PGRN水平与IL-6(r=0.617, P=0.001,图2A)显著相关。而且,经过GC治疗后,PGRN浓度仍与IL-6(r=0.583, P<0.01,图2B)显著相关。结论我们检测了PGRN在pSS患者外周血中的表达水平,初步探讨了PGRN在pSS的表达及意义。本研究结果得到以下的结论：(1).PGRN在pSS患者的外周血清中浓度显著高于健康对照人群,PMBC的mRNA及蛋白的表达亦高于健康对照人群；(2).无论在治疗前还是治疗后pSS患者中PGRN的浓度与IL-6浓度呈线性相关；(3).糖皮质激素可显著降低PGRN在pSS患者中的表达。总之,PGRN参与了pSS的发生发展过程,且浓度的高低与SLE的疾病活动性相关。据此我们推测PGRN可能在pSS发生、发展中起重要作用,可能为pSS的诊治提供新的方向。研究背景系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)好发于20岁到40岁之间的育龄女性,是一种多态性的自身免疫性疾病,至今病因不明。SLE发病的病理特点是自身抗体的高表达和免疫复合物的沉积,常常累及机体的多个系统和器官。SLE的病因不明,其发病和遗传,环境的相互作用有关。自身免疫耐受平衡的打破导致了自身免疫性疾病的发生发展,SLE也不例外。糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)是强有力的抗炎和抑制免疫药物,广泛应用于治疗SLE,皮肌炎等自身免疫性疾病。糖皮质激素是治疗SLE的主要的、最有效的治疗药物。然而,部分SLE患者存在激素抵抗,甚至需要大剂量激素。鉴于糖皮质激素的广泛的副作用,如库欣综合征、骨质疏松、诱发或加重感染等,对于激素不敏感或抵抗患者有必要减小激素用量或及早加用其他免疫抑制剂。因此,探索激素抵抗的机制对于SLE的治疗至关重要。糖皮质激素主要通过与GR结合形成GC-GR复合物,然后再与DNA结合调节基因转录而发挥作用,可以显著减少炎性细胞因子如NF-κB、AP-1转录,降低自身反应T细胞、B细胞的基因表达。目前已经发现6种激素受体亚型：GRα、GRβ、GR γ、GRp、GRA和GRB。其中GR α是介导GC作用的主要成分,而GR β不与GC结合,不能激活激素介导的作用,对GRα有抑制作用。同样的,在许多疾病中发现GRα、GR β不均衡,或GRα/GRβ比例失衡与激素抵抗有关。热休克蛋白90(HSP90)是激素受体重要的分子伴侣,在GC效应中起重要的调节作用。目前尚无GR、HSP90与SLE激素抵抗相关性的报道,本研究检测了激素敏感型和激素抵抗型SLE外周血单个核细胞GRα、GRβ和HSP90的表达,旨在揭示GRα、GRβ和HSP90在SLE患者中表达的意义及与GC治疗反应的相关性。研究方法1.研究对象筛选我科2012年2月至2013年1月住院新诊断的且SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index)评分≥10的30例SLE患者进入实验组。他们的诊断均符合1997年美国风湿病学院修订的SLE的分类标准。所有的实验组患者入组前都未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂的治疗。入组后所有患者均接受了激素治疗,即泼尼松1mg/kg/day。连续给予泼尼松8周。根据患者对激素治疗的反应不同分为激素敏感组和激素抵抗组。即GC治疗8周后,临床症状、体征缓解,实验室指标正常为激素敏感；而症状、体征不缓解,实验室指标无改善,需要加用环磷酰胺等免疫治疗为激素抵抗。对照组包括30例年龄性别相匹配的健康成年人。所有研究对象均签署了山东大学齐鲁医院临床伦理委员会的知情同意书。2.实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析GRα、GRβ和HSP90mRNA的表达在实验组SLE患者接受泼尼松治疗的前后分别收集5ml外周抗凝血,用红细胞裂解液提取外周血中的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PMBC),根据说明书用Trizol法提取PMBCs的总RNA。核酸蛋白测定仪初步测定RNA的浓度并标准化至1ug/ml以利于接下来的反转录步骤。用反转录试剂盒获取cDNA后进行实时定量PCR检测PMBCs中GRα、GRβ和HSP90的mRNA的表达水平。3.统计分析用SPSS17.0软件进行结果的统计分析。实验数据经检验为非正态分布,用中位数(M)和四分位数间距(P25%-P75%)表示测得数据的平均水平和离散程度,采用非参数检验,认为P<0.05差异具有统计学意义。(英文摘要未改动)研究结果1.研究对象的临床特点30例SLE患者中,激素敏感组21例,激素抵抗组9例。激素敏感组男性2例,女性19例,年龄14-55岁,平均25.6±8.2岁。病程2-35月,平均10.3±5.1个月。SLEDAI评分,治疗前范围6-15分,平均9.2±3.1分,治疗后范围是0-6分,平均2.4±1.6分。激素抵抗组的9例SLE患者中的男性2例,女性7例,年龄13-52岁,平均22.6±9.6岁。病程3-34月,平均12.3±6.4个月。SLEDAI评分,治疗前范围8-22分,平均15.2±3.8分,治疗后范围是6-13分,平均7.1±3.4分。2.SLE患者与对照组PBMC GRα、GRβ和HSP90的mRNA表达SLE患者和对照组中均有GRα、GRβmRNA的表达,患者组与对照组比较差异无统计学意义；SLE患者HSP90mRNA表达高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)；GR β含量较低,在部分SLE患者及正常人中未检测出。3.GCS组和GCR组GRα、GRβ和HSP90的mRNA表达GCS组GRα mRNA表达水平高于GCR组,差异有统计学意义(p<0.05); GCR组GRβmRNA表达水平高于GCS组,差异有统计学意义(p<0.05)。GCR组HSP90mRNA表达水平升高,但无显著意义。结论我们的研究显示,SLE患者HSP90表达水平升高,SLE患者激素抵抗可能与GRα表达降低、GRβ表达升高有关。