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背景在男性生殖系统内,一定水平的雌激素对于维持正常的生殖发育和精子发生至关重要。成年哺乳动物睾丸的雌激素主要来源于睾丸间质细胞(Leydig cells,LCs),其合成过程受到芳香酶的催化。Cyp19是芳香酶的编码基因,其转录活性受到多个转录因子的调控,主要包括SF-1、LRH-1、CREB和CREM。转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)主要通过其经典的受体/Smad通路调节多种生物进程,TGF-βI型受体(TGF-βtype I receptor,TβRI)又称为ALK5(activin receptor-like kinase 5),在被TGF-β1信号活化后可以磷酸化Smad2/3,并通过Smad复合物将信号传递进细胞核并调控靶基因转录。我们前期研究表明,TGF-β1可以抑制大鼠睾丸间质细胞芳香酶的表达从而抑制雌二醇的分泌。为了进一步探究TGF-β1调节睾丸间质细胞分泌雌激素的机制,本实验首先观察了TGF-β1信号通路对芳香酶基因Cyp19相关转录因子表达的影响,然后在转录水平探索TGF-β1信号通路对Cyp19转录活性的影响,最后在mi RNA水平,进一步研究TGF-β1的调节机制。方法1.培养大鼠原代LCs和R2C间质瘤细胞,TGF-β1(5 ng/m L)孵育20 h;体视显微镜下向大鼠睾丸间质注射200μl TGF-β1(1μM),采用Western blot和免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术,在细胞水平和整体动物水平,检测TGF-β1对芳香酶基因Cyp19以及相关转录因子SF-1、LRH-1、CREB和CREM表达的影响。2.为了观察TGF-β受体在调节SF-1/LRH-1表达中的作用,原代LCs或睾丸间质给予TGF-β1及ALK5阻滞剂SB431542,Western blot检测SB431542对SF-1、LRH-1和CYP19蛋白水平的影响;同时提取睾丸间质液(testicular interstitial fluid,TIF),通过电化学发光免疫测定技术(electrochemiluminescence immunoassays,ECLIA)检测雌二醇(estradiol,E2)含量的变化。3.为了筛选LCs中参与TGF-β1通路的Smad分子,R2C细胞孵育TGF-β1(5 ng/m L)20 h后,收获细胞,Western blot检测Smad2和Smad3的磷酸化水平。4.向293T细胞转染含Cyp19启动子序列的报告基因载体和SF-1/LRH-1表达载体,然后孵育TGF-β1,通过双荧光素酶报告基因实验(dual-luciferase reporter gene assay)检测TGF-β1对Cyp19基因启动子转录活性的影响。5.向293T细胞转染含Cyp19启动子序列的报告基因载体和SF-1/LRH-1表达载体,同时共转染Smad2表达载体,通过双荧光素酶报告基因实验检测TGF-β1对Cyp19基因启动子转录活性的影响。6.R2C细胞孵育TGF-β1(5 ng/m L)20 h,提取总RNA,二代测序技术分析mi RNA表达谱,并通过靶基因分析,筛选出TGF-β1信号通路中可能以SF-1和LRH-1为靶基因的mi RNA,并通过q RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)进行验证。结果1.在大鼠原代LCs细胞、R2C细胞和睾丸组织中,TGF-β1可以显著降低芳香酶基因Cyp19及其转录因子SF-1和LRH-1的表达水平,但对CREB和CREM的表达没有明显影响。2.在原代培养的LCs和整体动物水平上,SB431542均能明显恢复TGF-β1抑制SF-1和LRH-1的表达,并且在整体动物水平上SB431542还能明显改善TGF-β1抑制CYP19的表达和睾丸间质液雌二醇的合成。3.用TGF-β1刺激R2C细胞,Western blot检测Smad2和Smad3的磷酸化水平,结果显示Smad2磷酸化水平明显增强,而Smad3的磷酸化水平变化不明显。4.在293T细胞中,TGF-β1或过表达Smad2均可以明显降低SF-1或LRH-1诱导的Cyp19启动子活性。5.测序结果显示,TGF-β1作用下表达上调的mi RNA有37个,表达下调的mi RNA有23个。通过靶基因分析,筛选出TGF-β1信号通路中可能以SF-1和LRH-1为靶基因的mi RNA,利用q RT-PCR进行验证,结果显示,在TGF-β1刺激后,可能以SF-1为靶基因的mi R-21-3p,mi R-532-3和mi R-107表达量明显升高,可能以LRH-1为靶基因的mi R-339-5p表达量明显上调。结论1.TGF-β1在细胞水平和整体动物水平,抑制大鼠睾丸间质细胞Cyp19相关转录因子SF-1和LRH-1的表达,提示TGF-β1通过抑制SF-1和LRH-1的累积调节Cyp19基因的表达。2.阻断TGF-β1受体ALK5,可以减弱TGF-β1抑制LCs表达SF-1、LRH-1、CYP19和分泌雌二醇,提示TGF-β1通过其经典的受体信号通路,抑制转录因子SF-1和LRH-1的表达,继而减弱CYP19的表达和雌二醇的合成。3.TGF-β1刺激R2C细胞后,Smad2蛋白发生明显的磷酸化,Smad3的磷酸化水平很微弱,提示Smad2在TGF-β1抑制LCs表达SF-1和LRH-1的过程中发挥了主要作用。4.TGF-β1和Smad2均可以抑制SF-1/LRH-1诱导的Cyp19基因启动子转录活性,提示TGF-β1通过Smad2信号通路在转录水平抑制Cyp19基因的表达。5.以SF-1为靶基因的mi R-107、mi R-21-3p和mi R-532-3p,以LRH-1为靶基因的mi R-339-5p,在TGF-β1刺激下表达上调,提示这四种mi RNA可能在TGF-β1调节SF-1/LRH-1表达的过程中发挥重要作用。