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基因密码子扩展技术是通过遗传编码的形式将功能基团引入到蛋白质实现其新功能。目前主要基于氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对系统基因编码非天然氨基酸以及构建正交小分子配体对应用于蛋白质工程研究中。目前此正交系统在模式动物小鼠体内的应用已有报道,但尚无经济动物羊或牛等的应用报道。本文旨在研究利用基因密码子扩展技术调控羊功能基因的分子遗传育种方法。通过对免疫力相关蛋白粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,GCSF）的克隆、生物信息学分析与功能研究,利用 Nε-（叔丁氧基羰基）-L-赖氨酸（Nε-（tert-Butoxycarbonyl）-L-lysine,BocK）参与的正交表达系统构建以及羊原代细胞中BocK参与的功能性蛋白正交表达研究,阐明利用基因密码子扩展技术调控羊功能基因的分子遗传育种方法的可行性。论文包含三部分内容:1绵羊粒细胞集落刺激因子的克隆、生物信息学分析与功能研究GCSF调节中性粒细胞前体细胞的成熟、增殖和分化,在许多物种中得到广泛研究。为探讨绵羊GCSF（sGCSF）变异株的功能,本研究首先比较了其mRNA表达水平的差异,结果表明GCSFv2的活性和mRNA表达水平均高于GCSFv1。序列比对结果表明,它们与牛GCSF的同源性最高。其次克隆并表达预测的绵羊GCSF亚型及其保守的C末端（命名为GCSFwt）,并在哺乳动物细胞中稳定表达。纯化后的GCSF在体内和体外均具有不同的刺激粒细胞增殖分化的功能,GCSFwt为最佳。这些结果表明,羊GCSF的各种异构体都能够刺激前体细胞的增殖和分化,激活中性粒细胞的成熟,可用于研究有效的非抗生素蛋白药物。此外,GCSF还可以作为提高绵羊免疫力等遗传育种的候选靶点。2利用BocK参与的正交表达系统构建利用BocK参与的正交表达系统在多种原核和真核细胞中都有成功的研究报道,但是尚无该系统在羊原代细胞中的研究报道。本研究为了验证构建本系统的成功与否,将GFPwt/GFP151TAG作为报告基因融入非天然氨基酸的表达系统——利用BocK参与蛋白质表达的正交表达质粒,确认非天然氨基酸嵌入型质粒系统的可靠性。为了增加BocK参与的蛋白质合成的表达效率,对构建的表达系统进行了优化。分别用ExpiCHO-S细胞、HEK293F细胞、绵羊颗粒细胞和绵羊胚胎成纤维细胞进行转染测试,结果显示构建的质粒表达系统可以分别在几种细胞中利用BocK,在真核表达系统中将其嵌入到测试蛋白中,参与GFP151TAG-BocK蛋白的表达。本研究成功的构建了可以利用BocK参与蛋白表达的正交表达系统,并证明该正交表达系统在绵羊颗粒细胞和绵羊胚胎成纤维细胞中应用的可行性,为在羊中利用非天然氨基酸参与的功能性蛋白质表达及相应的表达调控的研究奠定基础。3羊原代细胞中BocK参与的功能性蛋白正交表达研究为了研究BocK参与功能蛋白GCSF3TAG-BocK表达的正交表达系统在羊细胞中应用的可行性,本文构建了哺乳细胞真核表达载体pRTL1-GCSF3TAG、pLou-PylRSwt-8xRU-GCSF3TAG-BocK 和 pLou-PylRSwt-8xRU-GCSFwt,分别检测非天然氨基酸BocK嵌入到各种突变型蛋白中的表达。表达和纯化的非天然氨基酸BocK嵌入蛋白GCSF3TAG-BocK,通过M-NSF60细胞检测,结果确认其具有生物学活性。将BocK嵌入型的GCSF注射到小鼠体内进行体内试验,包括体内代谢试验和刺激机体产生粒细胞及其祖细胞的动力学试验,结果显示注射到小鼠体内的GCSF3TAG-BocK蛋白与GCSFwt蛋白一致,在8h达到最大浓度,之后迅速代谢到低水平,24 h测试时可以检测到蛋白刺激机体产生大量粒细胞及其祖细胞。将纯化的GCSFwt/GCSF3TAG-BocK分别添加到颗粒细胞和成纤维细胞培养基中作为试验组,以培养基中未添加GCSF的细胞为对照,通过Alarmarblue检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;转染真核表达质粒到颗粒细胞中后,利用RT-PCR方法检测GCSF在细胞中的表达水平,利用Alamarblue检测细胞培养基上清中表达的GCSFwt/GCSF3TAG-BocK的生物学活性。结果表明,在24 h和48 h,在0.06-600 ng/mL的范围内随着加入GCSFwt/GCSF3TAG-BocK的终浓度增加,颗粒细胞活力升高。试验组颗粒细胞体外培养24 h后,与阴性对照组相比,细胞周期的分布显著改变。试验组凋亡率和对照组相比,48h检测时凋亡率显著降低（P<0.05）。转染后72 h,转染了携带GCSF基因质粒的颗粒细胞中GCSF的表达量显著提高了 20万倍以上;转染了携带GCSFwt基因质粒和转染了携带GCSF3TAG基因质粒并在培养基中添加了 BocK的颗粒细胞培养基上清与对照相比有极显著的GCSF生物学活性。在成纤维细胞中的结果表明,绵羊成纤维细胞培养基添加0.03-300 ng/ml GCSFwt/GCSF3TAG-BocK,细胞活力变化差异不显著。试验组与对照相比,细胞周期的分布显著改变。试验组（GCSFwt）与对照组相比,24 h和72 h检测时凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）。转染后72 h,转染了携带GCSF基因质粒的成纤维细胞中GCSF的表达量显著提高了 5万倍以上;转染了携带GCSFwt基因质粒和转染了携带GCSF3TAG基因质粒并在培养基中添加了 BocK的成纤维细胞培养基上清与对照相比有显著的GCSF生物学活性。综上表明,GCSF在体外培养的绵羊颗粒细胞中,可调控绵羊颗粒细胞周期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。GCSFwt和GCSF3TAG-BocK蛋白可以在绵羊颗粒细胞中表达并具有生物学活性。GCSF可调控绵羊成纤维细胞周期,抑制细胞凋亡;GCSF蛋白可以在成纤维细胞中表达并具有生物学活性。BocK参与功能性蛋白GCSF3TAG-BocK表达的正交表达系统可用于分子遗传育种。