【摘 要】
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目的:制备新型组织工程移植物复合体（ASCs/CBD-bFGF/BDDM）,体内外评估其性能,并探索其在糖尿病大鼠背部创面的治疗效果。方法:1.利用冰冻切片机制备BDDM,通过H&E染色、Masson染色、免疫组化、DAPI、SEM等检测与NDT 比较评估性征。2.雄性SD大鼠3周龄,提取ASCs,流式分析（CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105）、三系分化（成脂、成骨、成
【基金项目】
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湖南省自然科学基金（2017JJ2006）；
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目的:制备新型组织工程移植物复合体（ASCs/CBD-bFGF/BDDM）,体内外评估其性能,并探索其在糖尿病大鼠背部创面的治疗效果。方法:1.利用冰冻切片机制备BDDM,通过H&E染色、Masson染色、免疫组化、DAPI、SEM等检测与NDT 比较评估性征。2.雄性SD大鼠3周龄,提取ASCs,流式分析（CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105）、三系分化（成脂、成骨、成软骨）鉴定。ASCs培养于温控培养皿中制备ASC-sheet并评估性征。3.CBD-bFGF蛋白表达载体植入大肠杆菌BL21（DE3）菌株合成CBD-bFGF,SDS和WB鉴定。qRT-PCR、IF和成管实验检测CBD-bFGF和NAT-bFGF对ASCs内皮诱导能力。Elisa检测CBD-bFGF和NAT-bFGF在BDDM上结合与缓释。CBD-bFGF 和 NAT-bFGF 负载于 BDDM 制备 CBD-bFGF/BDDM 和NAT-bFGF/BDDM,CCK8、LIVE/DEAD、qRT-PCR、IF、成管实验和免疫原性试验评估性征。4.健康8周龄雄性SD大鼠96只,STZ腹腔注射建糖尿病模型。直径2cm打孔器,建背部皮肤缺损模型。根据覆盖创面移植物随机分4组:DDM组、BDDM组、CBD-bFGF/BDDM 组和 ASCs/CBD-bFGF/BDDM 组。5.术后0天、7天、14天、21天创面连续拍照,计算创面愈合率。6.术后14天、21天,H&E染色和Masson染色评估其愈合情况。7.术后第7天,免疫荧光（CD31、α-SMA）评估创面血管再生。结果:1.ASCs呈纺锤形,三系分化染色显示阳性。流式鉴定CD29、CD90和CD105阳性,CD11b、CD34 和 CD45 阴性。2.H&E和DAPI显示细胞成分完全去除。MT和IHC染色显示胶原和纤连蛋白保留完好。SEM显示皮肤微观结构疏松。3.qRT-PCR和细胞IF验证CBD-bFGF和NAT-bFGF诱导后ASCs内皮标志物（CD 31,vWF,CD 144）转录明显高于TCPs组,且成管能力明显增强。4.CBD-bFGF相比NAT-bFGF在BDDM 的结合能力更强。CBD-bFGF/BDDM上的CBD-bFGF释放更加持久。5.CCK8 和 Live/Dead 验证 CBD-bFGF/BDDM 无细胞毒性。TNF-α、IL-6和IL-1β检测验证CBD-bFGF/BDDM低免疫原性。6.DDM和BDDM组创面相似,且明显低于CBD-bFGF/BDDM组和ASCs/CBD-bFGF/BDDM 组。ASCs/CBD-bFGF/BDDM 组创面明显优于CBD-bFGF/BDDM 组。7.H&E和MT显示术后14天和21天ASCs/CBD-bFGF/BDDM组的创面再上皮化率和胶原沉积明显优于其他组。8.术后7天组织IF检测血管内皮指标（CD31和α-SMA）,ASC/CBD-bFGF/BDDM组明显优于其他组。结论:1、新型组织工程移植物（ASCs/CBD-bFGF/BDDM）通过促进创面中血管生成、肉芽组织生长、胶原沉积和再上皮化协调促进糖尿病创面愈合。2、本研究表明ASCs/CBD-bFGF/BDDM是一种很有前景的促进DFU愈合的组织工程皮肤移植物。
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