基于单壁碳纳米管的生物传感器和基因载体的研究

来源 :南开大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:libra163
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在本论文中,我们研究了基于单壁碳纳米管(SWNTs)的生物传感器和基于SWNTs的纳米基因载体。一方面,作为天然的纳米和分子导线,SWNTs具有很高的电导率和极好的载流性能,因而是用于化学和生物化学检测的理想材料,当用作电化学检测的电极材料时,它们显示出具有极大的增强电子转移的能力。另一方面,功能化的SWNTs显示出可以穿透哺乳动物细胞,并且没有毒性,因而,SWNTs可以用作一些分子进入细胞的载体,尤其可以潜在的用作DNA、siRNA和疫苗传递在内的临床治疗。 在基于SWNTs的生物传感器研究中,我们首先采用了一种包括几次超声一离心在内的类似于“萃取”的方法对硝酸纯化过的SWNTs进行后处理,得到了纯度很高的SWNTs。这种SWNTs修饰的玻碳电极对过氧化氢的检测显示了极好的还原电流响应,其线性电流响应在1.99×10-5~1.12×10-2M浓度范围内为12.2μA/mM(r=0.999),是裸玻碳电极电流响应(0.08μA/mM)的150倍。然后,我们将葡萄糖氧化酶(GOx)利用其表面的氨基和SWNTs上的羧基通过共价键连接到一起,并用其制备了葡萄糖传感器。实验结果表明,与SWNTs进行化学键键接后,GOx仍保持了其活性,对葡萄糖检测的线性电流响应在9.6×10-4~1.296×10-2M浓度范围内为1.5μA/mM(r=0.995),这种共价键连接的方式比物理吸附的方法具有更好的电子传递效果和更高的检测灵敏度。 然后我们又通过非共价键吸附的方法制备了二茂铁和SWNTs的复合物,发现它具有很好的稳定性,并大大增强了对过氧化氢检测的灵敏度,通过电化学检测、水解作用和其它光谱等证明显示,二茂铁与SWNTs是通过强烈的π-πstacking相互作用连接起来的,这种π-π共轭在增强电化学催化性能中扮演了重要角色,这种复合物对过氧化氢的检测显示了极低的电流响应电位,提供了一种方便且稳定的电极材料,可用于检测有过氧化氢产生的许多生物化学反应。结合该复合物的特点,我们进一步建立了基因检测体系,该基因检测体系利用SWNTs-Fc对过氧化氢检测的放大作用,先将一条DNA探针序列固定在金电极上,再将第二条DNA探针序列连接到SWNTs-Fc复合物上,通过与目标DNA的杂交反应,将SWNTs-Fc连接到金电极上,通过检测过氧化氢得到电流响应。这种三明治式的杂交体系,减少了对目标DNA的处理和功能化,方便而高效的检测出互补DNA序列,这里SWNTs进行了双功能化,既起到固定探针DNA分子和电活性分子的作用,又起到增强电子转移扩大信号的作用。 由于使用SWNTs做成各种纳米器件的一个关键问题是按照预定的模式将SWNTs组装起来,因而在这一部分研究的最后我们利用互补DNA序列的特异性相互作用将DNA功能化的SWNTs组装成枝状结构,原子力显微镜图像显示这种枝状结构的形成是基于互补DNA序列的碱基特殊的配对作用。统计分析结果表明自组装后SWNTs的平均长度是单股DNA功能化的SWNTs的七倍。这种基于DNA杂交的SWNTs自组装为制备用于各种电子器件和分子检测所需的纳米多功能结构提供了潜在的方法。 在基于SWNTs的基因载体研究中,我们研究了功能化的SWNTs做为基因进入细胞的载体,在基因治疗方面的应用。我们首先采用有荧光标记的双股DNA(20个碱基对)连接的SWNTs(SWNTs-dsDNA-FAM)确定了功能化的SWNTs进入不同细胞的能力。在这里,我们分别调查了SWNTs介导的DNA在免疫调节细胞和不同肿瘤细胞的体外和体内传递。对于免疫调节细胞,体外实验结果表明SWNTs-dsDNA-FAM确实可以进入具有吞噬作用的单核细胞RAW264.7,而且也可以进入成熟和未成熟的树突细胞,但由于成熟的树突细胞吞噬能力降低,所以进入较少。体内实验结果表明SWNTs-dsDNA-FAM优先被大的鼠脾细胞吸收,一些小细胞群如T细胞和B细胞不能吸收。进一步分析表明,它可以被CD11b+细胞吸收。对于不同肿瘤细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪清楚显示鼠肺癌细胞、鼠宫颈癌细胞、鼠卵巢癌表皮细胞都能很好的吸收SWNTs-dsDNA-FAM。并且体外和体内实验均没有观察到明显的毒性。随后,我们又制备了正电荷负载的SWNTs(SWNT-CONH-(CH2)6-NH3+Cl-,SWNTs+),然后分别用CD80siRNA和鼠端粒酶反转录酶siRNA(murinetelomerasereversetranscriptasesiRNA,mTERTsiRNA)与SWNTs+形成复合物,SWNTs上的正电荷显著增强了siRNA在SWNTs上的负载。体外和体内实验表明,CD80siRNA:SWNT+复合物可以进入成熟和未成熟的树突细胞等免疫调节细胞并导致特定基因表达降低。同时体内注射也显示该复合物可以优先被肿瘤相关性Gr-1+CD11b+细胞吸收并降低目标基因。这为利用SWNTs转染siRNA进行体内免疫治疗提供了可能性。另一方面,mTERTsiRNA:SWNTs+复合物可以快速进入三种鼠肿瘤细胞,抑制mTERT表达和肿瘤细胞生长。而且将该复合物注入植有Lewis肺癌的小鼠体内,显示肿瘤生长被抑制。这些结果表明正电荷负载的SWNTs可以高效携带siRNA进入免疫调节细胞和肿瘤细胞降低目标基因的表达。最后,我们初步探索了同时具有靶向性和示踪功能的双功能化SWNTs在体外的靶向作用,为进一步研究既具有靶向性又具有治疗功能的双功能化SWNTs奠定了基础。
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