圆锥铁线莲是浙北地区习用的一种中药,常被用于肿瘤和慢性前列腺炎的治疗,疗效肯定,前期研究发现有效成分含量偏低,阻碍了圆锥铁线莲的开发应用和推广。植物的生长发育往往受到多种环境因子的影响,其中紫外光作为一种常见的环境胁迫因子,对植物生长发育具有重要的影响。前期我们探索了紫外光以及暗培养(HUVB+D)胁迫对圆锥铁线莲代谢途径的扰动,结果发现双重胁迫能促使圆锥铁线莲中有效成分含量增加,其中香豆素增加最为显著,且已经完成了关键酶多酚氧化酶(PPO)的克隆和真核表达研究。基于上述研究基础,本文对圆锥铁线莲中香豆素生物合成途径中的关键酶PPO的功能进行深入探究,并对香豆素生物合成途径中的异戊烯基转移酶(PT)进行了发掘、鉴定、克隆和表达,主要研究内容如下:(1)圆锥铁线莲中多酚氧化酶的功能探究利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)建立PPO低表达的圆锥铁线莲植株模型,并利用qRT-PCR和酶活实验对模型进行验证。蛋白质组学分析发现,与空载植株相比(VV),在PPO沉默植株(VC)中的蛋白出现了明显的变化,其中与次生代谢,蛋白质代谢,氧化还原,光合作用和糖酵解途径相关的蛋白的表达量出现上调。结合HUV-B+D进行的差异蛋白质组学分析则进一步显示其与光合作用,糖酵解,胁迫,氧化还原和蛋白质代谢相关的蛋白在VC植株中明显高于VV植株。Mapman分析表明,差异表达的蛋白主要参与了光合作用中的光反应阶段和卡尔文循环。结合qRT-PCR和光合特性研究表明,在VC中,HUV-B+D处理前后其ATP合酶表达水平,叶绿素含量和光合速率均明显高于VV。上述结果表明了对PPO的沉默可能通过激活糖酵解途径,调节卡尔文循环,为能量代谢提供ATP,进而对植物的光合作用起到促进作用。该研究为农业生产中提高作物产量提供了有益的参考。(2)圆锥铁线莲中香豆素异戊烯基转移酶的克隆和表达通过生物信息学分析,结合TBLASTN比对,获得了 4条评分较高的圆锥铁线莲中香豆素异戊烯基转移酶序列,运用PCR实验得到了三条包含完整开放阅读框的序列。与已有的PcP T比对分析发现三条序列与其相似度分别为3 5%,41%和42%,且都含有异戊烯基转移酶共有的特征序列:NQ×D××D和KD(I/L)×D×(E/D)GD(×代表任意氨基酸),进化树分析显示其中两条位于香豆素异戊烯基转移酶分支,一条位于尿黑酸异戊烯基转移酶分支。QRT-PCR结果显示,三条序列经过HUV-B+D处理后都出现上调,但仅有CtPT1的变化趋势与CtPPO和香豆素的变化趋势一致。推测CtPT1可能是参与香豆素生物合成的异戊烯基转移酶基因,其具有400个氨基酸,分子量为44.1kDa,等电点为9.32,是一个不稳定的疏水蛋白,具有8个跨膜区,是一个膜结合蛋白。通过构建pESC-CtPT1-GFP重组载体,在酵母中诱导表达,得到了目的蛋白。SDS-PAGE结果发现因为pESC空载体的表达蛋白浓度较高,并没有观察到明显条带,结合Western bloting实验证明其在酵母中成功表达。通过构建pMDC83-CtPT1重组载体,农杆菌介导其对烟草叶片侵染,共聚焦观察显示CtPT1-GFP定位于叶绿体,证明CtPT1是一个叶绿体膜结合的蛋白。对其组织特异性分析发现其在圆锥铁线莲的根茎叶花中都有分布,但在根和叶中的含量较高,叶片中的含量是根中的2倍。