研究背景:心脏重构(CardiacRemodeling)是心力衰竭病程的关键组成部分,为舒张性心力衰竭的主要原因。由于心脏长时间处于过重的负荷中,疾病初期表现出一定的代偿功能,当出现高水平的心肌纤维化、氧化应激反应增强、大量心肌细胞坏死及凋亡时,将阻碍心脏的正常功能。持续性心肌肥厚最终可致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死。在一定条件下心脏可再生,心肌细胞、心脏干细胞均能有效增殖,所以积极探索抑制心脏重构不良以及心脏再生的相关作用机理,是治疗心力衰竭的一个重要策略。已证实很多信号途径均和心脏重构存在紧密的联系,也有多类药物应用于不同的环节。因此,从细胞分子水平调控心肌肥厚的进程,发掘新的抗心室重构的治疗新靶点成为当前心衰治疗的热点。咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester CAPE)是蜂胶中的主要成分之一,它属于柑橘类黄酮,为有机酸中的酚酸类物质,具有羟基苯丙烯酸类结构。具有很好的抗炎症性和抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤和免疫调节等作用。因此,对于治疗因氧化应激反应、病毒感染等引起的病变可发挥一定的疗效,包括脑组织障碍、心血管疾病、感染HIV(人免疫缺陷病毒)、血小板及白细胞减少症等。但值得注意的是,当前尚无研究阐明CAPE治疗心脏重构的详细作用机理,所以本研究将深入探讨CAPE在心脏重构过程中对心肌肥大、纤维化的影响。研究目的:本研究主要通过采用主动脉缩窄术建立动物模型,检测CAPE在正常生理状态和病理性压力负荷重构过程中的表达变化,验证CAPE在心肌重构及纤维化过程中的作用;运用H9C2体外的实验来阐明CAPE参与心脏重构调控的确切作用机制;最后结合实验数据讨论CAPE是否可作为心室重构的新的治疗靶点。研究方法及结果:第一部分:心肌肥厚动物实验:选取野生型C57小鼠8-10周龄,体重23.5-25.5之间的健康雄性小鼠,将研究动物随机分成下列四组:CAPE假手术组、对照假手术组、CAPE手术组与对照手术组,选择主动脉缩窄术构建小鼠模型,顺利建模后对不同组别采用不一致的处理周,术后第3天给予经口 CAPE药物干预和6周后取材。取材后用蛋白印迹来检测心脏中CAPE蛋白表达。主要通过以下指标检测心脏重构各过程和相关分子机制情况:1.通过心动超声仪对各组研究动物的LVSd、LVPWD、LVDd、LVEF、LVPWS及FS进行检测;2.通过血流动力学对各组研究动物的EF、ESP、FS、dPdtmin及dPdtmax进行检测;3.通过解剖探讨各组研究动物HW(心脏重量)、LW(肺脏重量)、HW/BW(心脏体重比)及HW/TL(心脏重量助骨直径比)等指标;4.通过HE染色法探讨各组研究动物的心肌细胞横截面积、心脏体积等指标;5.通过实时定量PCR探讨各组研究动物表达的ANP、BNP、a-MHC(a-MHC-肌球蛋白重链)、β-MHC(β-肌球蛋白重链)的mRNA等增生标记物水平;6.通过Western blot检测各组小鼠心脏中信号通路信号分子的表达情况;结果:1.超声及血流动力学检测结果:假手术组LVDd(3.31 ±0.12)、LVDs(2.46±0.13)、LVPWd(90.68±0.07)、LVPWs(1.01±0.02)、ESP(100.82±3.80)、ED P(12.04±0.23)、EF(81.25±2.16),FS(46.00±1.99),dPdtmax(9653±262.97),dPdtmin(9138.5±304.88)(P<0.01 vs CON),而AB组小鼠LVDd(5.00±0.13)、LVDs(3.80±0.07)、LVPWd(1.17±0.05)、LVPWs(1.33±0.03)、ESP(127.27±3.8)、EDP(20.90± 1.46)、dPdtmax(6520.16±529.95),dPdfmin(6142.16±413.53)各项指标均较假手术组升高,EF(58.87±2.62),FS(23.75±0.99)反而降低,差异均有显著性(P<0.01 vsCON).AB术后经CAPE处理组L VDd(4.37±0.14)、LVDs(3.27±0.14)、LVPWd(0.816±0.02)、LVPWs(1.20±0.37)、ESP(139.11±5.2),dPdtmax(8057.83±356.54),dPdtmin(7707.66±563.05)各项指标均较 AB 组降低,EF(66.37±1.32),FS(30.00±0.72)明显升高,差异具有显著性(P<0.01 vs AB).2.组织形态学结果:假手术组 BW(22.43±0.58),HW(114.87±8.45),LW(136.75±3.73),HW/BW(4.21±0.08),HW/TL(6.57±0.39),而 AB 组小鼠各项指标较假手术组升高到 BW(27.57±0.46),HW(215.87.87±12.1),LW(168.23±3.94),H W/BW(7.62±0.67),HW/TL(11.68±0.62),差异均有显著性(P<0.01 vs CON)。经 CAPE 处理后各指标分别下降到(25.38±0.50),HW(182.875±6.65),LW(155.87±4.24),HW/BW(6.43±0.21),HW/TL(9.82±0.32)差异具有显著性(P<0.01 vs AB)3.病理切片HE染色结果:组织切片显示AB术后小鼠心脏体积、心肌细胞横截面积增大,经CAPE处理后心脏体积和心肌细胞横截面积明显缩小。4.实时定量PCR结果:与对照组小鼠相比AB术后ANP、BNPa-MHC-肌球蛋白重链(a-MHC)Mrna和β-肌球蛋白重链(β-MHC)等心肌增生标记物表达显著增加(P<0.01 vs CON),经CAPE处理后各项心肌增生标记物指标明显下降差异具有显著性(P<0.01 vsAB);5.Western blot结果:AB术后压力负荷增加引起小鼠心肌MEK/ERK信号通路显著激活,CAPE能抑制MEK/ERK信号通路的磷酸化,差异具有显著性(P<0.01 vsAB)。第二部分:心肌纤维化动物实验:选取8-10周龄,体重23.5-24.5之间的健康雄性C57小鼠,主动脉缩窄述建立压力负荷诱导的心肌重构模型,经口 CAPE药物干预和6周后取材;断椎处死小鼠,快速取出心脏并称重,同时记录小鼠的肺重与体重;收集的心脏随机分为两组,一组取左室保存于-80℃用于蛋白印迹和RT-PCR检测;另一组心脏经10%KCl停跳在舒张期后,脱水、包埋后切片后用于病理染色。主要通过以下指标检测心肌纤维化过程和相关分子机制情况:1.通过PSR染色法探讨各组研究动物的心肌纤维化水平;2.通过RT-PCR实时定量法对各组研究动物表达的心肌纤维化介质TGF-β,胶原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)和胶原蛋白(collagen Ⅲ)水平进行检测;3.通过western blot法探讨各组研究动物表达的Smad蛋白级联蛋白水平;结果:1.PSR染色结果:AB术介导慢性压力负荷上升导致左心室纤维化增强,CAPE显著下降,胶原水平及体积增大;2.PCR结果:AB术组心肌组织表达高水平的TGF-β,collagenⅠ及collagen Ⅲ(P<0.01 VS CON),AB术后经CAPE处理组各项指标明显下降(P<0.01 VS AB);3.Western blot法结果:AB术组表达高水平的磷酸化Smad1/5、TGF-β及Smad3(P<0.01 VS CON),相比于AB手术组,CAPE可明显抑制表达Smad1/5、TGF-β及Smad3的磷酸化,差异具有显著性(P<0.01VSAB)。第三部分:体外细胞实验细胞实验:采用H9C2大鼠心肌细胞作为实验对象,通过苯肾上腺素(PE)诱导建立离体细胞肥大模型,分为对照组,CAPE处理组,PE刺激组和PE+CAPE处理组。分别于完全培养基中加入苯肾上腺素(PE,50uM)或仅为完全培养基培养24h。检测细胞中CAPE在蛋白水平的变化趋势。细胞爬片后免疫荧光检测细胞中CAPE的表达。用免疫印迹检测心肌组织CAPE蛋白表达水平。结果:1.免疫荧光结果显示,经培养24小时后,PE诱导的H9c2细胞表面扩大,经CAPE给药组各组细胞面积均较PE刺激模型组减小。2.采用Western blot方法检测结果:PE显著地激活了 MEK/ERK信号通路,而经CAPE的处理抑制了被激活的MEK/ERK信号通路的活动,差异具有显著性(P<0.01 VSAB)。结论:1.主动脉缩窄术所致的慢性压力负荷可以引起小鼠心肌肥厚、心肌纤维化;2.CAPE可以以抑制压力负荷诱导的心肌肥厚,该作用是通过阻断MEK/ERK信号通路信号通路实现的;3.CAPE通过级联蛋白信号通路TGF-β、Smad1/5及Smad3降低慢性压力负荷引起的心肌纤维化;4.CAPE可以抑制PE诱导的大鼠心肌细胞肥大;该作用是通过阻断MEK/ERK信号通路信号通路实现的,进一步对在体研究做出验证;