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邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是邻苯二甲酸酯类(PAEs)的一种,是一种常用的增塑剂。它能够引起中枢神经和周围神经系统的功能性变化,并且具有致畸、致癌、致突变作用[1]。DBP被美国国家环境保护署(USEPA)和欧盟(EU)共同列为优先控制污染物[2]。PAEs在环境中的迁移,水解作用,挥发作用和光解.作用并不是重要的反应过程,换言之,它们在环境中很难被降解,属于难降解物质,而生物法是自然环境中PAEs矿化的主要途径。在各种去除PAEs的方法中,微生物降解被认为是最有效的方法[3]。本论文以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为研究对象,对其进行微生物降解研究。(1)通过对从八个省份不同污染地区采集的土壤样品进行降解菌株筛选,得到一株可以以DBP作为唯一碳源和能源生长的细菌菌株,其菌落呈黄色。通过16S rRNA基因序列测序鉴定其为Glutamicibactersp.,并将其命名为Glutamicibacter sp.strain 0426。(2)将菌株0426接种于含有DBP的无机盐培养基中,在30℃,pH=7,180 rpm的黑暗条件下进行振荡培养,开展降解实验。当DBP初始浓度为300 mg/L时,经11小时DBP的降解率达到99.9%,并可在12小时内得到宗全降解。当降解完成后,培养液呈淡黄色并伴随油滴状DBP的消失,降解过程伴随菌株0426的生长,菌株0426由初始浓度1.8X 107 CFU/mL逐渐变成8× 107 CFU/mL。当初始浓度为500mg/L时,DBP可在20小时内接近完全降解,降解效率为99.6%。当初始浓度为700 mg/L时,DBP可在36小时内接近完全降解,降解效率为99.8%;当初始浓度为1000 mg/L时,DBP可在40小时内接近完全降解,降解效率为99.5%。且四种不同浓度的DBP降解曲线均符合一级降解动力学方程,降解速率斜率分别为0.2351,0.1006,0.0719,0.0552,随着浓度的增大斜率变小,R2均在0.91以上。由动力学方程可知,随着DBP初始浓度的增大,动力学斜率减小,降解半衰期延长,这表明随着DBP初始浓度的增加,降解速率降低。(3)在DBP初始浓度为300 mg/L时,分别考察培养温度为20、25、35、37、40℃时DBP的降解情况,发现在30、35、37、40℃条件下DBP均能在12h内完全降解;且35℃时降解效率更高。在20℃和25℃条件下,DBP的降解效率较低。表明在温度较低时,DBP的降解效率降低;35℃是菌株0426降解DBP的最适温度。当DBP初始浓度为300mg/L,分别考察pH值为5、6、8、9时其降解情况,结果表明pH值为6、7、9时DBP基本上均能在12h内完全降解,但pH为7时,降解速度更快。而pH为5时,DBP基本不降解。由此可见,在酸性条件下DBP无法降解,而降解最适pH为中性。(4)提取菌株0426基因组DNA进行全基因组测序分析,基因组分析结果表明,菌株0426基因组大小为 3,554,926 bp,G + C 含量为 63.05%,包含 3304 个 CDS,3 个 rRNA,64个tRNA,67个ncRNA。未检测到质粒。并将测序结果提交至GeneBank获得登录号为No.NZ_MPBI00000000。通过对基因组编码基因注释分析,从中筛选出与降解相关的基因,对其进行表达活性分析。通过逆转录PCR分析发现,在以DBP为唯一碳源的情况下,所选基因均可以诱导表达,证明这些基因所编码的蛋白有活性且参与降解反应。在以DBP、果糖作为唯一碳源的条件下,比较降解基因转录活性的差异进行荧光定量PCR分析,结果表明所选降解基因的转录活性上调,证明其可被DBP诱导表达。(5)利用GC-MS对DBP的降解产物进行分析,鉴定得到6种降解产物,包括邻苯二甲酸,邻苯二甲酸丁基甲基酯,邻苯二甲酸乙基甲基酯,邻苯二甲酸二甲酯,苯甲酸甲酯以及丁酸。基于降解产物分析及降解基因转录活性分析结果,可推导出DBP的降解途径,即DBP通过水解生成邻苯二甲酸,也可直接生成丁酸进入三羧酸循环。邻苯二甲酸则通过转酯生成邻苯二甲酸丁基甲基酯,邻苯二甲酸乙基甲基酯,邻苯二甲酸二甲酯和邻苯二甲酸甲酯。邻苯二甲酸通过羟基化生成原儿茶酸,原儿茶酸转化为β羧基粘康酸酯,再转化为γ羧基粘康酸内酯,随后转化为β酮基己二酸烯醇内酯,而β酮基己二酸烯醇内酯最终转化为琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A并进入三羟酸循环,将DBP完全矿化。(6)分别对灭菌和非灭菌土壤添加DBP(1mg/g),接种菌株0426,开展生物强化土壤降解DBP实验。结果表明,在灭菌土壤中,经菌株0426生物强化组,3天时间内DBP降解率为96.6%,6天后的降解率为98.1%;而在非强化对照组中,DBP的浓度基本保持不变。在未灭菌土壤中,非强化对照组中土壤中原有的菌群对DBP也有一定的降解作用,6天后DBP的降解率为45.6%,但随后不再继续降解;生物强化组6天后DBP降解至检测线以下,即在菌株0426和土壤中原有菌群的共同作用下将土壤中的DBP完全降解。由结果可知,土壤中的土著菌群可影响菌株0426降解DBP的速率,但也有一定的促进作用。