在冠状动脉搭桥手术中,人工小血管作为移植材料,由于许多难以克服的问题使用受到限制,因此经交联处理的同种异体小血管被认为是未来自体小血管的最佳替代物,从而成为研究焦点。最为常用的小血管交联方法是使用戊二醛,其交联原理明确,为氨基端交联,交联效果肯定,但其存在一系列副作用,如细胞毒性,组织钙化等;一种新的交联方法—染料介导的光氧化法可以克服戊二醛交联的一系列副作用,但其作用机制目前尚不完全明确。本实验采用荧光显色的方法,应用荧光材料5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯,利用其能与蛋白氨基特异性结合,在波长为488nm的激发光下发出绿色荧光这一特点,检测戊二醛及染料介导光氧化处理的小血管交联程度,并初步探讨染料介导光氧化处理的小血管交联原理。第一部分戊二醛法处理的小血管交联程度检测的研究目的:利用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯能与蛋白氨基特异性结合,在波长为488nm的激发光下发出绿色荧光这一特性,检测经戊二醛交联后小血管氨基残端的变化,从而评价不同浓度戊二醛处理的小血管交联程度,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳法相对比。方法:以戊二醛交联的新西兰兔经脱细胞处理的胸主动脉作为研究对象,按与其作用的戊二醛浓度不同分组,分为阴性对照组—未与戊二醛作用(A组),浓度0.625%组(B组),浓度1.25%组(C组),浓度2.5%组(D组),与戊二醛作用30分钟后,洗脱戊二醛,将小血管作快速冰冻切片,与5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯作用2小时,洗脱游离的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯,在荧光显微镜下观察各组荧光强度差异;同时提取各组血管组织蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,对比此两种方法以评价不同浓度戊二醛处理的小血管交联程度。结果:(1)荧光显微镜下观察荧光强度,阴性对照组(A组)＞浓度0.625%组(B组)＞浓度1.25%组(C组)＞浓度2.5%组(D组),差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。(2)应用戊二醛处理的小血管,组织蛋白提取量较未处理组明显减少,但不同浓度处理组间差异不明显。结论:5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯是一种有效的荧光试剂,可以清楚的反映小血管氨基残端的变化,与聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比,可以更为方便且直观的评价经戊二醛处理的小血管交联程度;在一定时间内,小血管交联程度随着戊二醛浓度的增大而增加。第二部分染料介导光氧化法处理的小血管交联原理初步探索及交联程度检测研究目的:利用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯能与蛋白氨基特异性结合,在波长为488nm的激发光下发出绿色荧光这一特性,检测经染料介导光氧化交联后小血管氨基残端的变化,从而初步推断染料介导光氧化法交联原理,进而评价染料介导光氧化法处理的小血管交联程度。方法:以染料介导光氧化法交联的新西兰兔经脱细胞处理的胸主动脉作为研究对象,按其光照作用时间不同分组,分为阴性对照组-未光照组(A组),光照2小时组(B组),光照4小时组(C组),洗脱染料后,将小血管作快速冰冻切片,与5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯作用2小时,洗脱游离的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯,在荧光显微镜下观察荧光强度差异,以此评价蛋白氨基残端的变化,从而初步推断染料介导光氧化法交联原理,进而评价染料介导光氧化法处理的小血管交联程度。结果:荧光显微镜下观察荧光强度,阴性对照组(A组)＞光照2小时组(B组)＞光照4小时组(C组),差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。结论:5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯是一种有效的荧光试剂,小血管氨基残端减少,说明染料介导光氧化法交联与氨基端有关;在其它条件不变的情况下,一定时间内,小血管交联程度随着光照时间延长而增加。