重症急性胰腺炎（SAP）是临床上常见的危重急腹症，尽管近年来对此疾病的研究不断地深入，但患者常因全身炎症反应综合征（SIRS)，多器官功能衰竭（MOF)死亡，临床治疗相当棘手。近期的研究发现，直接威胁SAP患者的不是胰腺坏死，而是肠道细菌移位，肠源性内毒素血症以及胰腺的继发感染。SAP患者早期就可出现肠黏膜上皮细胞通透性地增高，使得肠道内大分子物质如毒素、炎性介质等穿过通透性增高的肠黏膜上皮进入血液循环和淋巴组织，使机体出现SIRS，引起多器官功能衰竭（MOF）的发生，因此肠道被称为SIRS和MOF的“枢纽器官”和炎症介质的扩增器，减轻肠黏膜屏障功能障碍对阻止疾病的发展，改善SAP患者的预后显得至关重要。、　　紧密连接结构(TJ)是位于肠黏膜上皮细胞间的一种特殊细胞结构，可受到多种因素的调节，并可影响细胞的通透性，由多种跨膜蛋白（Occludin，Claudin-1，ZO-1）等组成其主要作用是封闭相邻细胞间的裂隙，有效地防止大分子物质沿细胞间隙渗入，对于屏障功能的维持和紧密连接的完整性具有重要作用。另外，上皮细胞骨架对上皮细胞形态变化和细胞裂隙的形成也起着重要的作用，主要成分是肌动蛋白F-action,F-action由跨膜蛋白（Occludin）和紧密连接周边蛋白(ZO-1)组成的连接复合物与细胞间紧密连接相连，构成稳定的连接系统，维持细胞骨架的正常形态和紧密连接的稳定性。该结构使肠黏膜上皮屏障功能的完整性得以维持，可有效地阻止肠腔内大分子物质如细菌、毒素及炎性介质等的转运。当炎症介质、细胞因子、缺氧等损伤作用于上皮细胞时，骨架蛋白重组，可引起细胞收缩，使细胞与细胞间紧密连接松散，细胞间裂隙形成，使得通透性增高，大分子物质通过上皮细胞旁路途径转运。　　RhoA/Rho激酶信号转导通路是体内普遍存在的一条信号通路，在细胞信号转导通路中作为信号转换器作用于细胞骨架蛋白或其它靶蛋白后，调控细胞骨架重排，维持细胞的紧密连接，并调控基因转录及细胞周期等。RhoA/Rho激酶信号通路可在促炎介质、细胞因子和氧化应激等刺激时被激活，通过下游效应器Rho激酶(ROCK)发生作用，导致肌动蛋白微丝滑动，细胞收缩，细胞骨架重组，紧密连接蛋白成分的减少，而导致细胞通透性增高，但是SAP时肠黏膜上皮细胞通透性的变化是否也有RhoA/Rho激酶信号转导通路的参与尚鲜见报道。　　连续性肾脏替代治疗（continuousreplacementtherapy，CRRT）已成为SAP综合治疗的有效的手段之一，其作用主要与炎症介质的清除，内皮细胞功能的改善，以及免疫动力学稳态的恢复相关。但研究已发现SAP的预后与肠黏膜屏障功能损害密切相关，CRRT对SAP的治疗作用是否与降低肠黏膜上皮细胞的通透性，改善肠黏膜屏障功能障碍，减轻SIRS的发生有关，改善SAP的预后，目前罕见报道。　　目的：　　本研究以SAP患者为研究对象，观察CRRT治疗对SAP患者血生化指标、CRP、血清TNF-a、APACHEⅡ评分和预后的影响，以血清DAO、D－乳酸水平和肠黏膜上皮细胞的通透性作为评价肠黏膜屏障功能的指标，并进一步从细胞水平上观察CRRT对肠上皮细胞间紧密连接结构蛋白（Occludin和ZO-1）、骨架蛋白F-action表达的影响，以及对RhoA/Rho激酶信号转导通路活化的影响，探讨连续性肾脏替代治疗对SAP患者肠黏膜屏障功能的影响及可能存在的机制。　　方法：　　1.研究对象：选取2010年1月～2011年6月在重庆医科大学附属第一院确诊为SAP的患者85例，其中男性53例，女性32例，平均年龄23～76岁（47.3±14.8）岁，SAP的诊断参照1992年亚特兰大国际胰腺炎会议制订的标准。SAP患者按入院时间先后随机分组，根据治疗方案的不同，分为CRRT组52例（常规治疗+CRRT），非CRRT组33例（常规治疗）。二组患者在性别、年龄、在APACHEⅡ评分等方面无统计学差异（P＞0.05）。另以20例健康志愿者作为正常对照，其中男性12人，女性8人，平均年龄（41.2±10.8）岁。所有病人在诊断SAP之后立即予以常规综合治疗，CRRT组在次基础上联合连续性肾脏替代治疗（CRRT）治疗，分别于CRRT治疗前（0h），治疗后12小时（12h）和24小时（24h）时采集静脉血，分离血清，分装后于-80℃备用。　　2.动态观察CRRT治疗前后患者APACHII评分、检测血清生化指标的变化情况。　　3.测定CRRT治疗过程中血清二胺氧化酶、D-乳酸、CRP和TNF-a的变化。　　4.以人Caco-2细胞建立肠黏膜单层上皮细胞模型，将SAP患者CRRT治疗各时间点采集的无菌血清加入共培养，并以健康人的血清为对照。分别检测跨膜电阻（TER）和对FD4的通透量作为评价肠黏膜上皮的通透性的指标，同时观察CRRT治疗对肠黏膜上皮的通透性影响。　　5.激光共聚焦显微镜观察上述各组血清共培养的Caco-2细胞紧密连接蛋白和肌动蛋白F-action的分布和重排情况；Western-blot检测细胞紧密连接蛋白和骨架蛋白F-action表达水平的变化。　　6.实时荧光定量PCR方法检测上述各组刺激培养的上皮细胞内的RhoA/Rho激酶基因表达水平的变化。　　结果：　　1.2组患者治疗前APACHEⅡ评分分别为（13.8±4.5）分，（14.1±3.7）分，2组比较差异无显著意义（P﹥0.05）。CRRT组经治疗后，患者APACHⅡ评分、血淀粉酶（AMS）、血肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）水平逐渐下降，与治疗前比较差异均有显著意义(P﹤0.05)，而碳酸氢根（HCO3-）均恢复到正常，与治疗前比较差异有显著意义(P﹤0.05)；而非CRRT组患者经常规治疗后，APACHⅡ评分，血淀粉酶和血肌酐、尿素氮水平虽较治疗前有所下降，但差异无显著意义（P﹥0.05），而碳酸氢根无变化。CRRT治疗组48例，治愈好转41例(占85.4％),死亡7例(占14.6%)；非CRRT组37例，治愈好转24例(占64.9%),死亡13例(占35.1%)，2组比较差异具有显著意义(P﹤0.05)。　　2.SAP患者肠道屏障功能的变化及CRRT对其影响：治疗前两组SAP患者血清DAO和D-lactate水平均明显高于健康对照组（(P<0.05)。与治疗前相比，CRRT组治疗12小时，血清DAO水平有所下降，但差异无显著意义（P﹥0.05），但血清D-lactate水平下降，差异有显著意义（P﹥0.05），CRRT治疗24小时，血清DAO水平进一步下降，与治疗前比较，差异具有显著意义(P<0.05)，同时血清D-lactate水平进一步下降，与治疗前比较，差异具有显著意义(P<0.01)。而非CRRT组患者经常规治疗后，血清DAO和D-lactate水平与治疗前比较无明显下降，部分指标甚至有所上升。进一步观察了SAP患者治疗前血清DAO和D-乳酸水平与APACHⅡ评分的关系，结果显示，血清DAO和D-乳酸水平与APACHⅡ评分呈明显的相关性（P<0.05）。　　3.治疗前两组SAP患者血清CRP和TNF-α水平均明显高于健康对照组（(P<0.05)，与治疗前相比，CRRT治疗12小时，CRRT组血清CRP和TNF-α水平有所下降，但差异无显著意义（P﹥0.05），CRRT治疗24小时，血清CRP和TNF-α水平进一步下降，与治疗前比较，差异具有显著意义(P<0.05)。而非CRRT组患者经常规治疗后，血清CRP和TNF-α水平与治疗前比较无明显下降。进一步观察了SAP患者治疗前血清DAO和D-乳酸水平与CRP的关系，结果显示，血清DAO和D-乳酸水平与CRP呈明显的相关性（P<0.05）。　　4.SAP患者血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞通透性的变化及CRRT治疗对其影响：与正常对照组相比，CRRT治疗前SAP患者血清共培养的肠黏膜上皮细胞TEER明显下降（P<0.01），而FD4通透性明显增高（P<0.01）。与治疗前相比，CRRT治疗12h后肠黏膜上皮细胞TEER增加（P<0.05），而FD4通透性下降（P<0.05），治疗24h后TEER进一步增加（P<0.05），而FD4通透性进一步下降（P<0.05）。　　5.SAP患者血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的分布及CRRT对其影响（激光共聚焦显微镜×200观察）：可见正常肠黏膜单层上皮细胞的Occludin和ZO-1主要分布在各细胞周围，并在细胞间形成光整、较连续的光带，但与SAP患者血清共同培养的肠黏膜单层上皮细胞可见Occludin和ZO-1分布有明显变化，其荧光染色减弱，部分连接断裂，连续性中断；CRRT治疗12h时血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞间Occludin和ZO-1荧光染色增强，细胞间连接断裂和不连续性得以改善，并一直持续到24小时。　　6.SAP患者血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞骨架蛋白的分布及CRRT对其影响（激光共聚焦显微镜×500观察）：可见正常单层肠黏膜上皮细胞的F-action，形成肌动蛋白丝带，排列规则整齐；但与SAP患者血清共同培养的单层肠黏膜上皮细胞可见F-action分布发生改变，肌动蛋白丝带断裂，排列紊乱，CVVH治疗12小时后肌动蛋白丝带不规则和断裂得以改善，尤以24小时最为明显。　　7.SAP患者血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白表达变化及CRRT对其影响：CRRT治疗前SAP患者血清共培养的肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达水平下降较健康对照组明显下降（P<0.05），治疗12h后细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平较治疗前明显升高（P<0.05），治疗24h时Occludin和ZO-1表达水平进一步增加（P<0.05），但仍低于正常。　　8.SAP患者血清共培养的单层肠黏膜上皮细胞骨架蛋白F-action表达变化及CRRT对其影响：与正常对照组相比，SAP患者CRRT治疗前F-action表达水平下降（P<0.05），与治疗前比较，治疗12h时F-action表达水平较治疗前明显升高（P<0.05），24小时F-action表达水平上升至接近对照组水平，与对照组无显著差异（P>0.05）。　　9.SAP患者血清共培养的肠黏膜上皮细胞RhoA和ROCK表达水平的变化及CRRT对其影响：CRRT治疗前，SAP患者血清刺激培养的单层肠黏膜上皮细胞RhoARNA和ROCKRNA的表达较对照组明显升高，与治疗前比较，在CRRT治疗12小时后，单层肠黏膜上皮细胞RhoARNA和ROCKRNA表达水平下降（P<0.05），24小时时，其表达水平下降尤其显著（P<0.01）。　　结论：　　1.SAP患者存在肠黏膜屏障功能损害，其损害程度可能与患者的预后相关。　　2.连续性肾脏替代治疗（CRRT）治疗不仅有效减轻了炎症反应（CRP），改善SAP患者的APACHEII评分，同时也改善了SAP患者的肠黏膜屏障功能的障碍。　　3.连续性肾脏替代治疗对SAP患者肠黏膜屏障的这种保护作用可能与其清除TNF-a等炎症介质，进而下调RhoA/ROCK信号通路活性,进而改善细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和骨架蛋白F-action的表达和重排，降低了肠上皮细胞的通透性，改善了肠黏膜屏障功能。