论文部分内容阅读
谷氨酰胺酶（Glutaminase,EC 3.5.1.2）能催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰基水解,生成具有鲜味的谷氨酸,在酱油等传统酿造食品加工过程中具有应用良好的应用潜力。针对酱油生产工艺中高盐和高温的特点,本研究以来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168的谷氨酰胺酶（YbgJ）为研究对象,基于B.subtilis WB600表达系统,通过饱和突变及N端融合自组装双亲短肽（Self-assembling amphipathic peptides,SAPs）等策略对谷氨酰胺酶的耐热性和耐盐性进行改造,以期提高其应用效果。主要研究结果如下:（1）谷氨酰胺酶的表达及性质分析将YbgJ基因克隆至载体pP43NMK,构建得到表达质粒pP43NMK-YbgJ,并转化B.subtilis WB600进行表达。酶活检测表明,重组B.subtilis WB600发酵15 h时,胞内谷氨酰胺酶活达到最高值149 U?mL-1。SDS-PAGE分析显示,重组B.subtilis WB600胞内具有分子量约为37kDa蛋白条带,与YbgJ理论分子量基本一致。经镍柱亲和层析纯化得到具有活性的YbgJ并进行酶学性质分析,结果如下:YbgJ比酶活达到563 U?mg-1;最适反应温度和55℃半衰期(t1/2)分别为50℃和10.79 min;最适反应pH为9.0,在pH 7-9,40℃保温6 h,残余酶活超过80%。在pH 5的酱油发酵模拟体系中,添加YbgJ（每5 mL模拟体系中添加2 U酶）后谷氨酸的含量较对照组（不添加YbgJ）提高了54%。上述结果表明,重组YbgJ在酱油增香工艺中具有应用潜力。（2）饱和突变提高谷氨酰胺酶的热稳定性为了提高YbgJ的热稳定性,利用Discovery studio 2018对YbgJ中具有不利相互作用的49个氨基酸进行虚拟突变,确定了影响酶热稳定性的关键氨基酸位点E3、E55、D213。对上述3个位点分别进行饱和突变,筛选得到55℃的t1/2较野生酶分别提高58%、69%和41%的突变体E3C、E55F和D213T。构建复合突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T,其t1/2分别较野生酶提高173%、144%、122%和97%。其中,E3C/E55F比酶活较野生酶提高23%,达到693 U?mg-1。进一步分析作用力发现,突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T分别较野生酶增加30、23、11和8个氢键及减少5、4、4和3个不利相互作用。结果表明,酶分子内部关键氨基酸的替换对YbgJ热稳定性有较大的影响,且分子内部不利相互作用的减少和氢键的增加可能是YbgJ热稳定性提高的重要原因。（3）N端融合SAPs提高谷氨酰胺酶的耐盐性为了提高YbgJ的耐盐性,基于B.subtilis WB600表达系统,将两类双亲短肽（AEAK、LELK）及PT-Linker分别融合至突变体E3C/E55F/D213T的N端,得到融合酶AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T。值得注意的是,融合LELK的YbgJ主要以活性包涵体形式表达。与E3C/E55F/D213T相比,AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T在18%NaCl溶液中处理120 min的残余酶活分别提高6.4倍和7倍,55℃的t1/2分别提高58%和69%。在pH 5的酱油发酵模拟体系中,添加AEAK-E3C/E55F/D213T和LELK-E3C/E55F/D213T（每5 mL模拟体系中添加2 U酶）谷氨酸的含量分别较对照组（添加E3C/E55F/D213T）提高69%和114%。研究获得的耐盐性及热稳定性提高的融合酶将有助于谷氨酰胺酶在酱油加工过程中的工业化应用。