红色诺卡氏菌发酵罐工艺及其抗肿瘤药理学进一步研究

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红色诺卡氏菌(Nocadia rubra PO-8)属于诺卡氏菌属。由于其细胞壁的组成和组织与红球菌属、棒状杆菌属和分支杆菌属相似而与其他革兰氏阳性菌不同,它们组成了一个超于种之上的分类单位-含分枝菌酸放线菌。含分枝菌酸放线菌的细胞壁主要由阿拉伯半乳聚糖和分枝菌酸组成,它们共价的组装成肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖-分枝菌酸母体,其被证实具有免疫调节活性。红色诺卡氏菌细胞壁骨架(N-CWS)在恶性肿瘤的治疗、宫颈糜烂及其创面修复中取得了很好的疗效。本研究得到了发酵罐培养条件单因素的最优,采用响应面分析方法确定最优培养条件。此时菌体生物量为26.64g/L,与预测值较为接近。回归方程能反应各因素的影响。此产量与原250mL摇瓶条件下的最高生物量相比提高了9.8%。建立的红色诺卡氏菌5L发酵罐发酵动力学模型,分别用Logistic方程和Boltamann方程建立了菌体生长动力学的模型和葡萄糖的底物消耗动力学模型。在恒定溶氧为10%的前提下确定了葡萄糖补料的最佳参数:初糖浓度为20g/L,最佳的补料时间为36h,最佳补糖的浓度为50g/467mL、最佳的补料次数为一次性投放。将优化后的分批-补料发酵与分批发酵比较,可使菌体生物量提高了43.91%。确定了N-CWS生产工艺中红色诺卡氏菌高压均质破壁适宜的工艺参数为:压力2250bar,控温25℃,循环次数3次,菌体浓度15%。随后的口服实验显示细胞碎片低、中、高剂量组对S180实体瘤的抑制率分别达到了23.96%、44.38%、60.65%,显示红色诺卡氏菌细胞碎片对小鼠S180实体瘤的抑制作用存在一定的剂量依赖性。对脾脏指数、胸腺指数和腹腔巨噬细胞吞噬能力影响的实验结果,都证明了红色诺卡氏菌细胞壁碎片能增强小鼠的非特异性免疫。同时,腹腔巨噬细胞内酸性磷酸酶的活性随着碎片剂量的增加而提高,且呈一定的浓度依赖性。分析了红色诺卡氏菌细胞壁骨架抗肿瘤有效成分,发现肽聚糖(PG)是N-CWS具有诱导肝癌HepG2细胞凋亡的物质基础。进一步的液吉姆萨-瑞士复合染观察HepG2细胞的形态实验结果也验证了这个结论。
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