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目的:中枢神经系统(central nerve system,CNS)的视神经损伤后其轴突无法再生,也使其成为阻碍视觉相关功能恢复的一大重要障碍。最近有研究发现通过基因工程介导的方法阻断神经再生抑制性基因的表达,具有明显促进中枢视神经再生的治疗作用,但是目前人体内较难实现对于特定组织靶基因的敲除,因而其临床应用仍有待进一步探究。本研究希望寻找一种基于神经营养因子,并具有临床应用前景的基因治疗方法来促进视神经的轴突再生。基于小鼠视神经损伤研究模型,我们发现骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)具有增强多种神经营养因子的促再生效果。随后,我们以营养因子IGF-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)为例,对OPN如何促进IGFR信号通路效应进行研究。我们旨在探究OPN促再生的作用位点,以及寻找诱导OPN作用于IGFR通路的分子靶点。方法:(1)筛选OPN和不同神经营养因子的促再生协同作用。我们通过向眼球玻璃体内注射神经营养因子重组蛋白(IGF-1,NGF,BDNF,NT3,CNTF)或联合注射表达骨桥蛋白的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)与神经营养因子重组蛋白,并于玻璃体内注射14天后在视神经根部后1-2mm位置,使用Dumont 5号镊对视神经夹持(Optic nerve crush,ONC)5秒。12天后注射视神经示踪剂CTB,2天后进行小鼠心脏灌注4%PFA后取出视神经,根据Alexa-conjugated CTB标记的轴突对视神经再生的情况进行评价;探究不同剂量IGF-1对于视神经再生的作用。(2)定位OPN促再生的作用位点。通过生物信息分析后,结合OPN序列上功能区与结合位点的特点,我们设计并包装AAV2/2病毒分别包含三种OPN短片段:N-端OPN片段,含有信号肽序列的C-端的OPN短片段,去除143-153aa整合素结合位点的OPN短片段。基于小鼠视神经损伤模型,采用向眼球内分别注射AAV-f OPN,AAV-n OPN/IGF-1,AAV-c OPN/IGF-1,AAV-OPN△143-153与重组蛋白r IGF-1的方法,通过比较CTB标记的轴突数量对不同OPN短片段协同IGF-1诱导视神经轴突再生的能力进行评价。(3)探究OPN对于IGF-1受体信号通路的激活作用。我们设定空白组、IGF-1组和OPN/IGF-1组分别刺激HEK293细胞与小鼠皮层神经元,作用后裂解细胞并收集细胞蛋白,通过western blot方法比较不同处理因素下HEK293细胞与小鼠皮层神经元上IGFR表达水平、IGFR磷酸化水平、效应分子S6磷酸化水平,用于评价IGFR信号通路的激活与Akt/m TOR通路的效应。(4)探究脂筏对OPN/IGF-1相互作用的影响。我们设定空白组、IGF-1组和OPN/IGF-1三组不同处理因素做用于HEK293细胞,并分别分离脂筏蛋白与非脂筏蛋白,使用western blot方法比较IGFR蛋白的表达情况;为充分验证结果,我们先使用100m M M-β-CD作用于细胞溶解其脂筏中胆固醇从而破坏脂筏结构域,再用IGF-1和OPN/IGF-1分别刺激细胞,观察IGFR蛋白表达情况。为探究脂筏蛋白在OPN/IGF-1促进小鼠视神经轴突再生中的作用。我们分为两组在眼球玻璃体内注射重组蛋白OPN/IGF-1与OPN/IGF-1/M-β-CD,各个蛋白注射剂量为1ug,并按照小鼠视神经损伤模型进行处理与分析。(5)探究整合素对OPN/IGF-1相互作用的影响。使用IGF-1、OPN、OPN/IGF-1分别作用于HEK293细胞,提取其脂筏蛋白并与IGFR受体偶联的Protein G磁珠进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP),利用western blot检测与IGFR受体结合的整合素β1,整合素β3表达情况;为进一步验证其脂筏结构域依赖性特点,我们使用100m M M-β-CD溶解脂筏胆固醇,观察其对于IGFR受体与整合素β1,整合素β3相互作用的影响;基于小鼠再生研究模型,分别采用重组蛋白OPN/IGF-1与OPN/IGF-1/Integrin-Ab作为处理因素,探究整合素抑制性抗体封闭整合素与其他蛋白结合的位点后对于OPN/IGF-1诱导的小鼠视神经轴突再生的影响作用。(6)确认OPN/IGF-1和整合素以及脂筏蛋白的相互结合。利用免疫共沉淀技术与western blot技术检测在IGF-1、OPN、OPN/IGF-1分别作用下与IGFR结合的整合素β1和Caveolin-1蛋白的表达情况;同时使用免疫共沉淀双向验证的策略,我们使用Caveolin-1预孵育Protein G磁珠进行免疫共沉淀,再次检测IGF-1和IGF-1/OPN分别作用下与Caveolin-1结合的IGFR蛋白的表达情况;利用Caveolin-1结合Protein G磁珠进行免疫共沉淀,通过western blot检测IGF-1与OPN/IGF-1对于Caveolin-1蛋白磷酸化水平的影响。结果:(1)CTB标记视神经结果显示,相比于单一使用神经营养因子,联合使用OPN/BDNF或OPN/IGF-1均可以显著促进视神经的轴突再生,尤其OPN/IGF-1的视神经再生效果最好,而协同使用其他神经营养因子与OPN对损伤视神经并无明显再生作用。即使已经报道具有诱导视神经轴突再生作用的CNTF,协同OPN使用后对轴突再生效果无增强的作用(2)通过STRING数据库对OPN蛋白分析显示,OPN结构上存在RGD整合素结合位点,可以与多种整合素家族成员发生相互作用;并且Signal P分析结果显示,OPN的1-16aa序列为信号肽区域;含有不同OPN功能区的AAV病毒与r IGF-1作用于小鼠模型中结果显示,N端OPN仍可以促进视神经轴突再生,而缺失整合结合位点的OPN短片段对于视神经再生的作用被明显抑制,从而说明OPN序列中整合素结合位点对于OPN/IGF-1增强视神经轴突的再生具有至关重要的作用。(3)在HEK293细胞上与小鼠皮层神经元上对于IGFR信号通路表达的检测结果显示,IGF-1与其受体IGFR作用后能够使得IGFR磷酸化并激活IGFR信号通路,并诱导效应分子S6发生磷酸化;OPN作用下增强了IGF-1对于IGFR磷酸化水平,从而更有效激活IGFR信号通路;并且OPN通过IGFR下游AKT/m TOR显著上调了S6激酶的磷酸水平。(4)使用OPN作用HEK293细胞可以显著增加脂筏上IGFR蛋白的表达;使用M-β-CD干扰脂筏结构域后,OPN对于脂筏上IGFR的调控作用被抑制;使用OPN/IGF-1作用于小鼠视神经损伤模型,可见其促进损伤视神经的轴突再生;添加M-β-CD共同作用后,OPN/IGF-1对于视神经轴突再生的促进作用被明显抑制。体内体外实验充分证明OPN对于IGF-1诱导的IGFR信号通路的激活以及下游效应作用具有脂筏结构依赖性。(5)使用IGFR抗体结合的磁珠进行免疫共沉淀,相比于单一使用IGF-1,OPN/IGF-1联合作用增强了IGFR与整合素β1,整合素β3结合效率;使用M-β-CD共同作用后,OPN促进IGFR与整合素β1,整合素β3的结合作用被明显抑制;小鼠体内实验中使用整合素抑制性抗体后OPN/IGF-1对于视神经再生的促进作用被明显抑制。(6)使用IGFR抗体预孵育的磁珠进行免疫共沉淀,在IGF-1激活IGFR信号通路作用下使用OPN后,OPN促进整合素β1以及Caveolin-1与IGFR的结合;使用Caveolin-1抗体进行免疫共沉淀双向验证,结果同样显示OPN促进了IGFR与Caveolin-1蛋白的结合;通过对Caveolin-1磷酸化蛋白的检测,显示IGF-1作用下可激活IGFR可以诱导Caveolin-1发生磷酸化,而添加OPN作用后,可以进一步增强Caveolin-1蛋白磷酸化的效果。结论:OPN能够增强神经营养因子IGF-1促进视神经再生。其作用机制是通过OPN结合整合素并促进其转运至细胞脂筏结构域与IGF-1激活的IGFR受体结合并诱导IGFR发生磷酸化,同时募集磷酸化Caveolin-1结合至IGFR上形成Integrin/IGFR/Caveolin-1复合物,从而更加有效地激活IGFR信号通路并通过下游AKT/m TOR信号轴发挥促进中枢视神经再生的作用。OPN/IGF-1联合治疗是一种具有临床应用前景的促进中枢视神经再生的方法。