目的研究A-PRF和i-PRF对人牙龈成纤维细胞(HGFs)增殖分化作用的机制,比较A-PRF和i-PRF生长因子的释放量(PDGF-BB、TGF-β1、EGF)以及A-PRF和i-PRF对HGFs增殖、迁移作用的影响。方法1.制备A-PRF及i-PRF均需抽取10ml静脉全血,以1500r/min离心14分钟得到A-PRF,以700r/min离心3分钟得到i-PRF,待A-PRF、i-PRF中的生长因子释放一周后,收集富含生长因子的培养液并配制A-PRF、i-PRF条件培养基。2.采用组织块贴壁法培养原代HGFs,选取对数生长期且生长状态良好的细胞进行实验,在倒置相差显微镜下观察细胞形态进行细胞形态学鉴定,通过鼠抗人波形蛋白染色及鼠抗人角蛋白染色进行细胞来源鉴定。3.通过酶联免疫吸附试验检测A-PRF、i-PRF在1、3、7天生长因子的释放量(EGF、PDGF-BB、TGF-β1);分别使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs 7天,通过qRT-PCR方法检测与软组织愈合相关基因的表达(COL1a2、FN1、TGF-β、PDGF);通过细胞增殖实验及DAPI免疫荧光染色法,探究A-PRF、i-PRF在1、3、7天对HGFs增殖作用的影响;Transwell制备细胞迁移模型,观察A-PRF、i-PRF对HGFs 24小时迁移情况的影响;分别使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs 7天,采用I型胶原蛋白免疫荧光染色法观察细胞I型胶原蛋白的表达。4.统计学方法:使用SPSS16.0软件进行分析,Shapiro-Wilk检验结果证实数据符合正态分布,Bartlett检验证实数据方差具有齐性,数据以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用Dunnett′st检验,检验水准为单侧α=0.05,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1.离心后得到的A-PRF可观察到明显分层,最上层为少细胞浆液层,中间一层是A-PRF,为胶冻状,最下层为红细胞层,离心后得到的i-PRF是液体,位于最顶层。将A-PRF、i-PRF配制成体积分数为15%L-DMEM条件培养基,用于实验组HGFs的培养,15%L-DMEM完全培养基用于对照组HGFs的培养。2.组织块贴壁法分离培养原代HGFs,从牙龈组织中分离得到原代HGFs大约一周时间,显微镜下观察细胞呈长梭形、胞体丰满,细胞贴壁生长,两周后细胞以组织块为中心开始汇集,呈放射状、漩涡状生长。细胞贴壁生长,且为长梭形,从形态学上初步认定为HGFs,通过波形蛋白(Vimentin)染色阳性结果和角蛋白(cytokeratin)染色阴性结果证明细胞为中胚层来源,为HGFs。3.酶联免疫吸附试验结果显示:A-PRF、i-PRF中均含有大量EGF、PDGF-BB、TGF-β1,第1天到第7天的释放量逐渐减少,第7天的释放量仍然维持在一个较高水平,但A-PRF与i-PRF在1、3、7天生长因子的释放量存在一定差异。qRT-PCR结果显示:使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs 7天后,COL1a2、FN1、TGF-β、PDGF在mRNA水平的表达均得到上调,然而A-PRF、i-PRF的上调作用存在一定差异(P<0.05)。细胞增殖实验及DAPI免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs,其增殖作用更加明显(P<0.05),但A-PRF、i-PRF两者间的促进作用无明显差异(P>0.05)。Transwell细胞迁移结果显示:使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs,24小时细胞迁移数量明显多于对照组(P<0.05),A-PRF和i-PRF相比,细胞迁移数量差异无统计学意义(P>0.05)。I型胶原蛋白免疫荧光染色结果显示:使用A-PRF、i-PRF条件培养基培养HGFs 7天,A-PRF、i-PRF对细胞I型胶原蛋白的表达有明显促进作用(P<0.05),i-PRF较A-PRF的促进作用更强(P<0.05)。结论1、A-PRF、i-PRF含有大量生长因子,其释放是一个缓慢持续的过程,A-PRF、i-PRF条件培养基具有适宜的生长因子浓度,对HGFs增殖及分化具有明显的促进作用,无毒性及抑制作用。2、A-PRF、i-PRF对HGFs的增殖、迁移、基因表达、I型胶原蛋白表达的促进作用存在一定差异。