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目的:本研究根据课题组前期建立的免疫程序制备抗rTgPRF多克隆抗体并体外监测其对正常细胞及弓形虫感染细胞生长、坏死和凋亡的影响。通过体内实验评价rTgPRF脂质体或rTgPRF联合弗氏佐剂免疫C57BL/6J小鼠后特异性抗体及CD4+/CD8+的变化,并进一步评估两种免疫方式对弓形虫感染小鼠的生存期、组织病理、生殖激素、细胞因子以及凋亡相关蛋白水平的影响,进而探讨rTgPRF疫苗的保护效力及机制,为其进一步的应用开发提供理论支撑和实验依据。方法:将pET30a（+）-TgPRF质粒转入E.coli BL21（DE3）中大量表达rTgPRF蛋白,通过AKTA系统经Ni柱和阴离子柱纯化后冷冻干燥。首先,制备抗rTgPRF多克隆抗体并检测其体外活性,将BALB/C-3T3成纤维细胞进行铺板后分别加入抗rTgPRF血清（1:40）或兔免疫前血清（1:40）,正常对照仅补充培养基,用Incucyte ZoomTM系统间隔1 h动态监测抗rTgPRF抗体对正常细胞生长、坏死和凋亡的影响。抗rTgPRF抗体对弓形虫感染细胞的影响同样进行了检测,将细胞铺板后预培养12 h,未感染孔设正常对照和抗rTgPRF血清对照（1:40抗rTgPRF血清）;感染孔均加入6×103个速殖子（RH株）,分为阴性对照（1:40兔免疫前血清）、同时干预组（感染时加入抗rTgPRF血清）,延迟干预组（感染12 h后加入抗rTgPRF血清）,间隔1 h监测细胞生长、凋亡和坏死。通过薄膜分散法制备200 nm及400 nm粒径的rTgPRF脂质体,低温超速离心法检测其包封率。进一步对rTgPRF脂质体及rTgPRF联合弗氏佐剂疫苗进行体内保护效果研究,将C57小鼠分为PBS对照组、空白佐剂组、空白脂质体组、纯蛋白组（20μg/只）,rTgPRF联合弗氏佐剂组分为10μg和20μg两个剂量组,r TgPRF脂质体组按粒径和剂量分为4个剂量组:400 nm粒径的10μg、20μg组以及200 nm粒径的10μg、20μg组。各组均皮下免疫小鼠三次,间隔两周,小鼠尾静脉采血检测IgG及亚型。末次免疫两周后,每组杀三只鼠取脾细胞进行CD4+/CD8+T淋巴细胞检测。剩余小鼠腹腔感染5×102个速殖子,感染89天尾静脉取血,离心收集血清进行生殖激素的ELISA检测和细胞因子芯片检测;取小鼠肝脏、睾丸固定后制作病理切片;荧光定量PCR检测小鼠睾丸、肝、脑的虫荷量并进行脏器中17种细胞因子、21种凋亡相关蛋白的芯片检测。结果:1.rTgPRF蛋白为可溶性表达,将冻干的rTgPRF蛋白复溶后经SDS-PAGE检测显示蛋白完整。体外实验表明抗r TgPRF抗体无细胞毒性,且显著抑制正常BALB/C-3T3成纤维细胞或弓形虫感染细胞的坏死,并促使其凋亡。2.制备的rTgPRF脂质体悬液经PVC滤膜整粒后,包封率可达85%左右。rTg PRF联合弗氏佐剂免疫小鼠后可诱导IgG1、IgG2b、IgG2c的升高（P<0.05）,而rTgPRF脂质体免疫则以IgG2为主,其中400 nm粒径rTgPRF脂质体的抗体水平优于200 nm粒径脂质体（P<0.05）,各免疫方式均可引起CD4+/CD8+比值升高。3.小鼠保护性实验显示,rTgPRF联合弗氏佐剂及rTgPRF脂质体免疫后均可延长小鼠存活时间,其中200 nm粒径的脂质体疫苗保护效果较差,而400 nm粒径脂质体疫苗比弗氏佐剂疫苗更能有效降低脏器（睾丸、肝、脑）虫荷（P<0.05）,病理损伤也更轻。弓形虫感染可使小鼠睾丸内的睾酮（T）、双氢睾酮（DHT）水平下降,而卵泡刺激素（FSH）升高,但不同方式的免疫保护后这些激素水平无明显改善（P>0.05）。rTgPRF联合弗氏佐剂免疫可使弓形虫感染小鼠血清中的促炎因子（IFN-γ、IL-6、IL-23 p19）进一步升高（P<0.05）,而400 nm粒径脂质体疫苗可使促炎和抗炎因子（IL-10、TGF-β1及IL-22）均升高（P<0.05）。400 nm粒径脂质体疫苗免疫后还体现出脏器局部免疫调节差异,与联合弗氏佐剂组相比,睾丸组织内的促炎因子和凋亡均显著增加（P<0.05）,脑组织促炎因子和凋亡亦小幅度上升但无差异（P>0.05）,而肝组织内促炎因子和凋亡则明显减弱（P<0.05）。结论:1.抗rTgPRF抗体具有直接抑制体外弓形虫速殖子增殖的效力,与其抑制细胞坏死、促进凋亡的活性密切相关。2.不同粒径的脂质体在激活免疫应答时有明显差异,400 nm粒径rTgPRF脂质体免疫保护效果优于200 nm粒径脂质体。3.rTg PRF蛋白疫苗在小鼠体内具有良好的抗弓形虫的保护效果,其中400 nm粒径的rTgPRF脂质体疫苗与rTgPRF联合弗氏佐剂相比更能有效降低脏器（睾丸、肝、脑）虫荷。rTg PRF联合弗氏佐剂免疫以Th1型应答为主,而rTgPRF脂质体疫苗在促进血清促炎/抗炎细胞因子平衡的同时,也体现出免疫调节的脏器特异性,并可通过Fas-Cytochrome c-Caspase-3途径促进细胞凋亡,此效应可能与有效降低脏器虫荷相关。