论文部分内容阅读
目的：构建小鼠C-X-C型趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor type4,Cxcr4）基因的慢病毒表达载体，体外验证其对小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSCs）的生物学特性的影响，探讨过表达CXCR4对MSCs归巢影响，以及对小鼠造血和免疫恢复及对GVHD防治作用。方法：（1）克隆小鼠Cxcr4基因，构建携带Cxcr4基因与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）双顺反子结构的重组慢病毒转移质粒LV-CXCR4-IRES-EGFP。脂质体法包装病毒，并测定滴度。（2）优化慢病毒感染MSCs条件，建立高表达CXCR4或EGFP细胞（分别定义为CXCR4-MSC和EGFP-MSC），绘制生长曲线，流式细胞术检测凋亡，划痕实验和Transwell实验检测体外迁移能力，Cell counting kit-8（CCK-8）法检测MSCs对小鼠原代淋巴细胞增殖影响。（3）受鼠接受全身照射（total body irradiation, TBI）24小时后尾静脉注射5×10~5个CXCR4-MSC或EGFP-MSC，冰冻切片观察MSCs在受鼠体内分布，流式细胞术检测归巢效率，酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测外周血和骨髓中基质细胞衍生因子1（stromalcell derived factor-1, SDF-1）水平。（4）建立小鼠同基因移植模型。照射24小时后输注5×10~5个CXCR4-MSC或EGFP-MSC，移植后外周血计数，流式细胞术测定骨髓中造血干细胞比例，组织病理学检测脾脏和骨髓。（5）以C57BL/6小鼠为供鼠， BALB/c小鼠为受鼠，建立异基因骨髓移植模型。受鼠接受TBI（条件同前）后随机分为5组：allo-BMT组（输注5×10~6个供鼠骨髓细胞（bone marrowcell, BMC）、GVHD组（allo-BMT组基础上+2×10~6个脾细胞（splenocyte, SP）、CXCR4-MSC组（GVHD组基础上+5×10~5个CXCR4-MSC）、EGFP-MSC组（GVHD组基础上+5×10~5个EGFP-MSC）和TBI组（输注等体积PBS）。移植后观察生存率，进行GVHD临床和病理评分；外周血细胞计数；流式细胞术分析免疫细胞恢复情况；流式微珠阵列法（Cytometric BeadArray, CBA）检测外周血中细胞因子水平。结果：（1）成功克隆小鼠Cxcr4基因，正确构建重组慢病毒载体LV-CXCR4-IRES-EGFP和对照载体LV-IRES-EGFP。成功制备共表达CXCR4和报告基因EGFP的慢病毒颗粒，浓缩后病毒滴度达1.8×10~8TU/mL。（2）优化条件后，慢病毒颗粒对小鼠MSCs感染效率可达70%。LV-CXCR4-IRES-EGFP感染组CXCR4的表达明显高于对照组。划痕实验和transwell实验表明，过表达CXCR4可明显提高MSCs向高浓度SDF-1的迁移能力。高表达CXCR4后对MSCs增殖与凋亡无明显影响，亦不影响MSCs对淋巴细胞的免疫调节效应。（3）冰冻切片与流式细胞术结果显示过表达CXCR4可明显提高MSCs归巢效率，ELISA结果显示照射24小时后小鼠外周血及骨髓中SDF-1水平明显升高。（4）在同基因骨髓移植后，输注MSCs不影响受鼠生存率，受鼠状态良好。输注CXCR4-MSC可促进外周血白细胞、血小板和造血器官恢复，且效果优于EGFP-MSC组，同时可促进骨髓中造血干细胞恢复。（5）异基因骨髓移植后联合输注MSCs可提高受鼠生存率，并且可促进受鼠精神、饮食、体重和活动等一般状况恢复。联合移植MSCs可降低GVHD临床和病理评分。输注CXCR4-MSC受鼠外周血细胞恢复较快，与GVHD组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，CXCR4-MSC组可加速外周血中免疫细胞恢复，并且输注CXCR4-MSC可调节异基因骨髓移植后细胞因子平衡，降低外周血中IL-2, IL-6,IFN-γ和TNF-α水平，增加IL-4和IL-10水平。结论：成功构建重组慢病毒载体LV-CXCR4-IRES-EGFP，慢病毒载体系统可高效介导外源性Cxcr4基因在小鼠MSCs表达，经体外验证其具有生物学活性。过表达Cxcr4基因可促进MSCs归巢，加速小鼠同基因和异基因骨髓移植后造血和免疫恢复，并可减轻异基因骨髓移植后GVHD。