论文部分内容阅读
目的:从昆明、BALB/c、C57BL/6三种不同品系的小鼠中筛选出适合HBV复制的实验动物模型,研究ICSII的体内抗HBV效应。研究ICSII的体外抗HBV效应。初步探讨淫羊藿次苷II抗乙肝病毒的机制。方法:第一部分:1.选取昆明、BALB/c、C57BL/6三种不同品系的小鼠,利用尾静脉高压水动力注射p AAV-HBV1.2质粒的方法建立HBV复制型小鼠模型。用实时荧光定量PCR技术检测不同品系小鼠血清中HBV DNA的拷贝量(当低于或等于临床阳性标准时,不在进行后续监测)。ELISA法检测不同品系小鼠血清中HBs Ag、HBe Ag的表达。统计不同品系小鼠血清中HBV DNA(高于阳性表达)持续时间和HBs Ag、HBe Ag的阳性率,筛选出适用于HBV复制的小鼠模型。2.以上述结果筛选出的HBV复制型小鼠模型为研究基础,分为模型对照组、ICSII组和恩替卡韦(entecavir,ENT)阳性药物对照组,分别进行生理盐水、ICSII(20mg/kg)、ENT(0.05mg/kg)连续灌胃给药20d,并分别在给药后第10d和第20d用实时荧光定量PCR法检测每组小鼠血清样本中HBV DNA的拷贝量,用ELISA法检测每组小鼠血清样本中HBs Ag、HBe Ag的表达量。第二部分:1.CCK8法测定不同浓度ICSII对Hep G2.2.15细胞的毒性效应。2.实时荧光定量PCR法检测ICSII对Hep G2.2.15细胞分泌HBV DNA的影响。3.ELISA法检测ICSII对Hep G2.2.15细胞分泌HBs Ag和HBe Ag的影响。第三部分:1.ELISA法检测ICSII对Hep G2.2.15细胞内GSH和GST表达的影响。2.Western-blot法检测ICSII对Hep G2.2.15细胞内SOD1表达的影响。结果:第一部分:1.HBV DNA:尾静脉注射p AAV-HBV1.2质粒后第4d时,昆明小鼠、BALB/c、C57BL/6三种小鼠血清中均可检测到HBV DNA的复制,转染的阳性率均为100%。统计分析显示,C57BL/6小鼠血清中HBV DNA(阳性表达)持续时间长于昆明小鼠和BALB/c小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。HBs Ag:尾静脉注射p AAV-HBV1.2质粒后,昆明小鼠、BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的HBs Ag阳性率分别为20%、95%、95%,统计分析显示,C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠HBs Ag阳性率高于昆明小鼠,差异均具有统计学意义(P<0.05)。HBe Ag:尾静脉注射p AAV-HBV1.2质粒后,昆明小鼠、BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的HBe Ag阳性率分别为10%、20%、90%,统计分析显示,C57BL/6小鼠HBe Ag阳性率高于昆明小鼠和BALB/c小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.以HBV复制型C57BL/6小鼠为体内实验模型,在ICSII(20mg/kg)连续灌胃给药小鼠10d和20d后,均可抑制小鼠血清中HBV DNA的复制和HBs Ag、HBe Ag的表达。在给药10d后,对HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag的抑制率分别为84.49%、13.92%、18.36%,与模型对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在给药20d后,ICSII对HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag的抑制率分别为65.38%、50.62%、43.05%,与模型对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第二部分:1.ICSII在12.5μg/m L浓度范围对Hep G2.2.15细胞没有明显毒性效应。2.ICSII低(6.25μg/m L)、中(10μg/m L)、高(12.5μg/m L)浓度组在24h、48h、72h对Hep G2.2.15细胞分泌HBV DNA均有抑制作用,且随着药物浓度的增加抑制作用逐渐增强。统计分析显示:ICSII中(10μg/m L)浓度组在24h、48h,高(12.5μg/m L)浓度组在24h、48h、72h时对HBV DNA有明显抑制作用,与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.ICSII低(6.25μg/m L)、中(10μg/m L)、高(12.5μg/m L)浓度组在24h、48h、72h对Hep G2.2.15细胞分泌HBs Ag和HBe Ag均有抑制作用,且随着药物浓度的增加抑制作用逐渐增强。统计分析显示:ICSII中(10μg/m L)、高(12.5μg/m L)浓度组在24h、48h、72h时对HBs Ag和HBe Ag均有明显抑制作用,与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第三部分:1.ICSII(12.5μg/m L)作用于Hep G2.2.15细胞72h后,细胞内GSH、GST的表达升高,且与对照组比较,差异具有统计学意义。2.ICSII(12.5μg/m L)作用于Hep G2.2.15细胞72h后,细胞内SOD1的表达升高,且与对照组比较,差异具有统计学意义。结论:第一部分:1.C57BL/6小鼠更适合用于HBV复制型小鼠模型的建立。2.ICSII可抑制HBV复制型C57BL/6小鼠血清中HBV DNA的复制和HBs Ag、HBe Ag的表达。ICSII对HBV DNA和HBs Ag的抑制效果与ENT相当,是一个潜在的抗HBV中药活性成分。第二部分:1.ICSII在12.5μg/m L浓度范围对Hep G2.2.15细胞没有明显毒性效应。2.ICSII对Hep G2.2.15细胞分泌HBV DNA有显著抑制作用。3.ICSII对Hep G2.2.15细胞分泌HBs Ag、HBe Ag有显著抑制作用。第三部分:抗氧化应激损伤可能是ICSII抗HBV的机制之一。