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目的:复制压力(replication stress)是内源性DNA损伤的主要来源,可能导致正常细胞突变累积,引起细胞衰老或者癌变。肿瘤细胞中,若复制压力不能有效缓解,肿瘤细胞会进入有丝分裂崩溃(mitotic catastrophe)状态,致使细胞死亡。因此,了解复制压力应答的分子机制,对于认识基因组稳定性和肿瘤治疗具有重要的生物学意义和临床意义。ATR是复制压力应答最重要的激酶,它能够被招募到裸露的单链(ssDNA)区域激活细胞周期检查点和缓解复制压力。ATR的这一特征使得ATR自身和其底物CHK1成为抗肿瘤的重要靶点。但关于ATR活化的分子机理仍有很多未知需要探索。蛋白质(包括组蛋白)翻译后修饰如磷酸化、泛素化和乙酰化在ATR激活过程中,起着很重要的作用,但是蛋白质甲基化是否参与以及如何调节ATR活性,尚未有相关报道。基于以上认识,该研究拟从组蛋白甲基化酶和去甲基化酶对ATR激活的功能筛选入手,以组蛋白去甲基化酶PHF8为研究对象,深入探索复制压力下ATR激活的分子机制,以期为复制压力异常相关疾病如肿瘤等提供可以靶向的酶分子或蛋白质结合位点。结果:1、PHF8能够影响ATR信号通路的激活。通过利用高通量筛选能够影响ATR信号通路激活的去甲基化酶以及甲基转移酶,找到了组蛋白去甲基化酶PHF8能够影响ATR下游底物RPA32其磷酸化形式pS33 foci的形成。进一步通过添加喜树碱(CPT)与羟基脲(HU)药物处理造成复制叉崩溃或停滞引起ATR信号激活发现,敲低PHF8影响ATR信号的活化,同时利用CRISPR/Cas9系统敲除PHF8也得到同样的结论。2、PHF8与TopBP1物理上存在相互作用。通过SILAC(细胞培养条件下稳定同位素标记技术)鉴定到与PHF8相互作用蛋白复合物中含有TopBP1,利用免疫共沉淀实验技术发现PHF8与TopBP1在多种肿瘤细胞系中存在相互作用,并且二者相互作用不依赖于DNA和RNA的。高盐离子洗脱也不能破坏二者相互作用。3、PHF8通过其C端22个保守的氨基酸与TopBP1的BRCT 7+8结构域存在直接的相互作用。构建TopBP1的缺失体以及PHF8的截短体,通过Co-IP实验进一步找到二者相互作用的区域。利用表面等离子共振技术(SPR)以及体外GST-pull down进一步观察到BRCT 7+8与22aa存在很强的相互作用。免疫荧光实验发现二者存在共定位。4、PHF8与TopBP1的相互作用以及其去甲基化酶活性能够促进ATR信号的活化。挽救实验发现在敲低PHF8之后,过表达野生型的PHF8(WT)能够重新促进ATR信号的激活,而过表达缺失22aa的PHF8(Δ22aa)则没有这个功能;过表达以及挽救实验发现酶活性丧失的PHF8(H247A)不能促进ATR下游底物的活化。5、PHF8通过去甲基化酶活性以及相互作用的22aa影响TopBP1在停止或崩溃的复制叉处的募集。敲低以及敲除PHF8导致TopBP1的foci形成数目减少,并且挽救实验发现只有野生型的PHF8能够重新促进TopBP1的募集,而酶活性突变以及缺失与TopBP1相互作用的22aa的PHF8没有这个功能。6、PHF8与TopBP1在乳腺癌组织中同时高表达会导致乳腺癌病人预后不良。7、PHF8的缺失使乳腺癌细胞对PARP抑制剂更敏感。细胞的活力测定以及小鼠荷瘤实验发现,缺失PHF8的乳腺癌细胞对PARP抑制剂Rucaparib更加敏感,而缺失PHF8导致在Rucaparib的作用下肿瘤生长速度减慢。结论:综上所述,本课题发现组蛋白去甲基化酶PHF8能够影响ATR信号的激活。接下来我们发现PHF8和TopBP1在体内、体外存在相互作用,并且PHF8是通过其C端的22个保守的氨基酸与TopBP1的BRCT 7+8结构域相互作用。PHF8负责与TopBP1相互作用的22aa以及它的去甲基化酶活性都能影响ATR信号的活化,并且PHF8与TopBP1相互作用的部分以及它的去甲基化酶活性也影响了TopBP1的募集;在临床组织样本分析中,我们发现PHF8与TopBP1在乳腺癌中的高表达会导致患者严重的不良预后;PHF8的缺失使乳腺癌组织更容易对临床靶向药PARP抑制剂敏感。该研究赋予了组蛋白去甲基化酶PHF8在复制叉停滞、崩溃过程中能够通过促进ATR信号的激活来促进复制叉的稳定,不仅使我们对ATR信号通路活化的调控过程有了新的了解,而且为PHF8在癌症的治疗中提供可能的靶点和治疗方向。