本研究首先建立了一种材料来源广泛、操作步骤简单的提取II型胶原蛋白的新方法,以牛软骨为原料利用氯仿和甲醇的混合液进行脱脂、胃蛋白酶溶液去骨膜,而后切碎利用盐酸胍去除蛋白多糖、再经消化、盐析、透析、冷冻干燥得到样品。将所得样品与II型胶原蛋白的标准品同时进行SDS-PAGE,电泳结果表明从牛软骨中提取得到的II型胶原蛋白无杂带、无降解、纯度高。而后以三种天然生物材料II型胶原蛋白、透明质酸和硫酸软骨素为原料按照四种不同比例,利真空冷冻干燥技术构建四种支架,采用EDC/NHS系统对四种支架进行交联,再次冷冻干燥。测定了交联后四种不同支架的形貌、交联度、孔径、孔隙率、吸水率和降解率。最终确定三种原料比例9:1:1为构建三维软骨支架的最优比例。再以壳聚糖为原料,并加入细胞转化生长因子TGF-β1通过乳化交联法并采用真空冷冻干燥技术制备了包裹TGF-β1的壳聚糖微球。测定了壳聚糖微球的形貌、吸水率、降解率,并绘制了TGF-β1体外累积释放曲线,计算载药量和包封率。所制得的壳聚糖微球外观为球状,球体表面光滑,分散较好,大小均匀,直径在100 nm左右,吸水率良好可达983.73±4.38%,抗酶解作用较强。由TGF-β1累积释放曲线可知TGF-β1在开始的24 h内释放最快,之后逐渐减慢,在120 h之后进入平台期,计算得壳聚糖微球载药量为25.6±0.23μg/g,包封率为80.21±0.02%。为了评价所构建支架的生物学性能,本试验将空白壳聚糖微球和包裹有TGF-β1的壳聚糖微球分别整合进三维软骨支架中并通过将小鼠软骨细胞ATDC-5接种于添加和未添加TGF-β1的三维复合软骨支架来观察细生长状态以验证三维软骨支架的生物相容性。MTT试验以及荧光染色试验结果充分说明由II型胶原蛋白、透明质酸以及硫酸软骨素构建的三维软骨支架非常适合ATDC-5细胞的生长增殖,并且壳聚糖微球对TGF-β1的缓释能够显著促进细胞的生长。