程序性细胞坏死是由于生物能障碍而导致的不可逆的组织损伤,是一种caspase非依赖性的细胞死亡形式。研究发现,程序性细胞坏死在神经退行性疾病、组织缺血再灌注损伤、炎症、败血症、多种实体器官损伤等多种疾病的发生发展中有重要的病理生理学意义。程序性细胞坏死信号的抑制或上调可影响疾病的发生与发展,表明程序性细胞坏死可作为多种疾病潜在的治疗靶点。对细胞坏死小分子抑制剂的进一步研究可能对寻找预防和治疗多种疾病的相关药物具有重要意义。2012年,有研究发现,在氧化应激条件下,p53蛋白能够与线粒体基质中的亲环素D（PPIF）形成复合物,使线粒体膜通透性转换孔（PTP）打开,引起线粒体内容物释放,从而导致细胞坏死。另外,研究人员还在中风模型小鼠的脑组织坏死区域检测到了p53-PPIF复合体,阻止该复合体的形成有助于减少脑中风的症状。线粒体p53-PPIF为氧化应激诱导的细胞坏死的重要促成因素,抑制该复合物的形成可能有助于防止因大量细胞坏死所导致的组织损伤,从而抑制疾病的发生发展。本研究利用构建的p53和PPIF相互作用调节剂筛选模型对本实验室保存的940多种小分子化合物进行筛选,期望可以找到抑制二者相互作用的小分子化合物,以期进一步找到抑制细胞坏死的先导化合物,为多种疾病的治疗提供新的靶向药物。具体研究如下:1、p53和PPIF相互作用调节剂筛选模型的鉴定。我们首先将前期已依据哺乳动物双杂交系统原理所构建好的pBIND-p53、pACT-PPIF真核表达载体及荧光素酶报告载体pG5luc利用磷酸钙转染法共转染入HEK293T细胞中,经荧光素酶活性检测结果证实,该作用模型启动了荧光素酶基因的表达,表明p53和PPIF相互作用调节剂筛选模型构建成功,可用于后续小分子化合物的筛选实验。2、筛选抑制p53和PPIF相互作用的小分子化合物。利用p53和PPIF相互作用调节剂筛选模型,对本实验室保存的940多种小分子化合物进行筛选。经过筛选发现,共有17种小分子化合物能够显著抑制p53与PPIF相互作用。以这17种小分子化合物作为候选化合物进行后续实验。3、目标化合物对H₂O₂诱导的细胞坏死的抑制作用研究。本研究首先利用MTT法检测了化合物的无毒浓度。结果发现,化合物T4-79、T6-26、A3-49、A3-66在工作浓度为5μg/ml时对HK-2细胞活力无明显影响。之后我们用H₂O₂诱导HK-2细胞坏死,并用无毒浓度的化合物处理细胞,通过MTT法检测化合物对HK-2细胞的保护作用。结果显示,化合物T4-79、T6-26、A3-49、A3-66均能够显著提高HK-2细胞在过氧化氢诱导下的细胞活力。台盼蓝染色结果也显示,这四种化合物预处理之后能够显著降低细胞台盼蓝染色阳性率,表明其能够抑制H₂O₂诱导的细胞坏死。为了进一步验证此结果,我们又进行了PI单染实验。结果发现,这四种目标化合物预处理之后再进行H₂O₂处理,可明显降低细胞的PI染色阳性率。接着我们检测了细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。结果发现,经目标化合物预处理之后再进行H₂O₂刺激,与DMSO+H₂O₂处理组相比能够显著降低LDH的释放,表明目标化合物预处理能够缓解HK-2细胞在H₂O₂刺激下的氧化损伤。最后通过Annexin-V-FITC和PI双染流式细胞术检测结果发现,与DMSO对照组相比,H₂O₂处理组PI阳性率明显增多。T4-79,T6-26目标化合物预处理组相比于H₂O₂处理组,PI阳性率明显下降。表明,T4-79,T6-26能够抑制H₂O₂诱导的HK-2细胞坏死。为了进一步探讨细胞死亡的机制,我们利用Western blot方法检测了HK-2细胞中MLKL以及p-MLKL的水平。结果发现,H₂O₂诱导组相比于DMSO处理组,p-MLKL蛋白水平明显增高,而通过T4-79、A3-49、T6-26或A3-66目标化合物预处理之后,p-MLKL蛋白水平有所下调。以上结果提示,四种化合物均可抑制细胞发生程序性坏死。综上所述,本研究通过利用PPIF和p53相互作用调节剂筛选模型,筛选出了T4-79、A3-49、T6-26和A3-66四种小分子化合物能够对H₂O₂诱导的HK-2细胞坏死具有抑制作用,为进一步开发抑制细胞坏死药物的先导化合物提供了新的思路,为脑中风、缺血再灌注损伤等多种疾病的治疗奠定了物质基础。