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MicroRNAs(miRNAs)是一种普遍存在的非编码小RNA,可与靶基因3’ UTR区靶向结合,进而抑制基因的表达。现已有研究表明MicroRNAs可通过靶向调控目标基因,来调节黑色素细胞内黑色素产生,影响毛色形成。但有关miR-338-3p对黑色素生成的影响尚未见报道。本研究运用多重生物学方法探寻miRNA-338-3p与MC1R之间的相互联系,从而深入了解miRNA-338-3p对黑色素生成的影响。试验方法及试验主要试验结果如下:1.以miRNA-338-3p为研究对象,通过Targetscan、miRBase等在线预测软件,筛选出参与色素合成的MC1R为靶基因,且预测了 miRNA-338-3p种子序列与羊驼MC1R-3’UTR区靶结合位点。2.构建双荧光报告载体与miRNA-338-3p真核表达载体,实验组(pmirGLO-MC1R-3’UTR 与 miR-338-3p)与对照组(pmirGLO-MC1R-3’UTR 与 miR-NC)共转染 293T 细胞。结果表明miR-338-3p共转染组荧光素酶相对活性检测值是NC共转染组的0.65倍,证明MC1R为miR-338-3p的靶基因。3.设立实验组(miR组,即转染miRNA-338-3p真核表达载体)与对照组(NC组,即转染真核表达空载体),将载体分别转染至两组羊驼黑色素细胞中,qRT-PCR检测实验组与对照组 miRNA-338-3p、MC1R、Mitf、Tyr、Tyrp1、Tyrp2 基因 mRNA 水平表达量。结果显示:(1)miR组miR-338-3p表达量是NC组的2.23倍,miR组极显著高于NC组(P<0.01)。(2)miR组中各目的基因mRNA表达水平显著降低,即MC1R、Mitf、Tyrp1及Tyrp2基因表达量较NC组分别下降0.85倍、0.702倍、0.746倍、0.51倍,差异均极显著(P<0.01);Tyr较NC组下降0.531倍,差异显著(P<0.05)。4.转染48h后,提取黑色素细胞蛋白质,采用蛋白免疫印迹法分别测定实验组与对照组MC1R、Mitf、Tyr、Tyrp2基因在蛋白水平的表达量。结果显示:miR组中MC1R、Mitf、Tyrp2在蛋白水平的表达量分别是NC组的0.509倍、0.289倍、0.486倍,差异均极显著(P<0.01);Tyr在蛋白水平的表达量是NC组的0.696倍,差异显著(P<0.05)。5.转染56h后,应用酶标仪测定各试验组中黑色素的A475吸光值,用各处理组黑色素A475吸光值占空白组的比值表示各组黑色素的相对产量。结果显示miR组黑色素相对产量为 0.4143048±0.0104589,NC 组黑色素相对产量为 1.000000±0.0200072,miR组较NC组下降59%,差异极显著(P<0.01)。综上所述,miR-338-3p可以靶向负调控靶基因MC1R的表达,顺势下调其下游相关基因mitf、Tyr、Tyrp1和Tyrp2的表达,从而减少羊驼黑色素细胞黑色素的生成。为研究miR-338-3p对羊驼MC1R调控机制提供了理论依据