论文部分内容阅读
中度嗜盐菌(Moderately halophile)指的是在含有3-15%NaCl的条件下表现出最适生长的一个微生物类群。与一般非嗜盐菌相比,中度嗜盐菌耐盐碱基因种类更多,其耐盐碱机制也更加复杂。因此,从嗜盐菌克隆耐盐碱基因并对蛋白功能进行鉴定,获得新型的耐盐碱基因以及高效耐盐碱的关键基因的几率更大,不仅可以增进人们对细菌耐盐碱分子机制的了解,而且所克隆的关键耐盐碱基因还可以用于构建高效耐盐碱的细菌基因工程菌株。本研究借助大肠杆菌(Escherichia col) Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc (AnhaA, ΔnhaB, ΔchaA),采用基因文库筛选法与基因功能互补法相结合的技术,首次从肇东盐单胞菌(H. zhaodongensis) NEAU-ST10-25中克隆获得两个Na+/H+逆向转运蛋白基因,它们分别是编码多亚基单价阳离子/氢逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter)的mrp操纵子和编码草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetate decarboxylase)的oadGAB基因簇。前者由于其表现出多种抗性以及pH相关的蛋白活性(multiple resistance and pH-related activity)而被主要定名为mrp(也被定名为mnh, pha或sha)。本研究中,我们沿用mrp一这一名称,并因其来自肇东盐单胞菌(H. zhaodongensis) NEAU-ST10-25而被定名为Hz_mrp.后者被定名为Hz_oadGAB。耐盐碱实验表明,Hz_mrp能够提供大肠杆菌(E.coli) KNabc对0.8M NaCl、100mM LiCl以及碱性pH8.0的抗性；而Hz_oadGAB能够提供大肠杆菌(E. coli) KNabc对0.4M NaCl、10mM LiCl以及碱性pH8.0的抗性,这暗示Hz_Mrp和Hz_OadGAB具有Na+/H+逆向转运蛋白活性。Hz_mrp操纵子全长6,400bp,包含7个完整的开放式阅读框架(ORF1-7),并且ORF1-7拥有一个共同的启动子和一个共同的终止子。同源性比对显示,Hz_mrp编码的各亚基分别与来自盐单胞菌(Halomonas sp.) GFAJ-1中推测的Group1型Mrp (Hs_Mrp)的七个亚基A-G的同源性最高(90.8%-99.3%)。相比之下,Hz_Mrp的各亚基与包括Sf_Pha2(来自Sinorhizo bium fredii)、 Bh_Mrp(来自Bacillus halodurans)、Bf_Mrp(来自B.firmus)、 Bs_Mrp (来自B. subtilis)以及Sa_Mnh (来自Staphylococcus aureus)在内的已鉴定的Mrp系统的相应亚基表现出有限的同源性,分别为33.6%-42.7%、30.9%-38.7%、35.1%-45.0%、34.0%-48.9%、28.2%-37.4%、25.8%-38.2%和32.8%-38.3%。以上结果暗示,Hz_mrp可能编码一个新型的Group1型Mrp系统。基于此,我们利用neighbour-joining算法构建Hz_Mrp的系统发育树,结果显示Hz_Mrp与几个推测的Group1型Mrp聚在一起且形成一个独立分支,这表明Hz_mrp的确编码一个新型的Group1型Mrp系统。Hz_oadGAB基因簇全长4,800bp,包含3个完整的开放式阅读框架(ORF1-3),并且ORF1-3均具有各自独立的启动子。同源性比对显示,Hz_oadGAB编码的草酰乙酸脱羧酶的a、β、γ亚基分别与伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)中推测的草酰乙酸脱羧酶中的相应亚基表现出最高同源性,分别为79.5%(α亚基)、78.8%(β亚基)和54.3%(γ亚基)。而与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中已被鉴定过的草酰乙酸脱羧酶的相应亚基同源性分别为62.5%-65.2%(α亚基)、68.1%-77.1%(β亚基)和34.7%～45.3%(γ亚基)。我们对Hz_OadGAB草酰乙酸脱羧酶脱羧活性进行鉴定,结果显示Hz_OadGAB具有显著的草酰乙酸脱羧酶活性,其最适反应条件为：37℃,pH7.0。此外,Hz_OadGAB的脱羧活性依赖于NaCl,且在100mM NaCl存在时,活性最高。为了进一步揭示Hz_mrp和Hz_oadGAB的钠离子输出机制,我们制备大肠杆菌(E.coli) KNabc/pUC-mrp和KNabc/pUC-oadGAB的反转膜(KNabc/pUC18为负对照),利用荧光猝灭的方法来检测它们的单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性。结果显示,由KNabc/pUC-mrp和KNabc/pUC-oadGAB制备的反转膜均具有Na+/H+和Li+/H+逆向转运蛋白活性,而提取大肠杆菌KNabc/pUC18的反转膜没有Na+/H+逆向转运蛋白活性,这表明Hz_mrp和Hz_oadGAB均编码Na+H逆向转运蛋白。同时,我们还发现提取于KNabc/pUC-mrp的反转膜还表现出K+/H+逆向转运蛋白活性,而提取大肠杆菌KNabc/pUC18的反转膜没有K+/H+逆向转运蛋白活性,这表明Hz_mrp还编码K+/H+逆向转运蛋白。我们进一步分析了pH值对Hz_Mrp活性的影响,结果显示,Hz_Mrp在pH6.5～9.5的范围内表现出的Na+(Li+, K+)逆向转运活性,且在pH8.5是活性最高,这表明Hz_Mrp的活性均对pH具有依赖性。底物亲和性分析显示,Na+、Li+、 K+的表观Km值分别是0.70、0.93、0.83,这表明Hz_Mrp的底物亲和性为：Na+>K+>Li+。基于以上结果,我们认为Hz_Mrp应该是一个新型的Group1型Mrp系统,具有Na+(Li+, K+)/H+逆向转运蛋白活性。Hz OadGAB同时具有草酰乙酸脱羧酶和Na+/H+逆向转运蛋白活性。