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目的：构建真核表达载体pcDNA3.1-AAH以及重组腺病毒Ad-AAH-IRES2-EGFP，分别用两种表达载体扩增、表达目的基因AAH，以满足实验及临床研究的需求。方法：1）从人原发性肝癌组织中提取总mRNA,逆转录PCR扩增AAH全长cDNA序列，通过TA克隆构建pMD18-T-AAH，并测序验证。2）以获得的pMD18-T-AAH为模板，PCR扩增AAH基因，与pcDNA3.1(-)双酶切后连接，构建pcDNA3.1-AAH，通过酶切，测序等方法验证序列。3）将获得的18T-AAH-1作为底物，采用Gateway技术构建腺病毒重组质粒Ad-AAH-IRES2-EGFP。4）同时将pcDNA3.1-AAH及Ad-AAH-IRES2-EGFP转染293T细胞，western blot检测AAH蛋白表达情况。结果：获得测序验证的AAH cDNA，成功构建pcDNA3.1-AAH及Ad-AAH-IRES2-EGFP，后者经扩增后纯化病毒浓度为5.0×109ifu/ml。转染293T细胞后，细胞中AAH蛋白表达显著高于对照组，也显著高于携带相同基因的质粒pcDNA3.1（-）-AAHASPH蛋白的表达。结论：用Gateway技术成功构建Ad-AAH-IRES2-EGFP，克服了传统重组连接多次酶切、工作繁琐、耗时长等缺点，获得较高纯度的重组腺病毒，并且同时构建pcDNA3.1-AAH，为后续研究基因功能、免疫治疗及实现重组载体产业化提供了基础。