牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中日韩三国重要的海水养殖经济鱼类,其雌性个体比雄性个体具有明显的生长优势,培育牙鲆的全雌群体能够提高单位养殖面积的产量。牙鲆的性腺分化不仅受到遗传因子的调控,还受到外界环境因子特别是温度和外源性激素的影响。尽管可以通过雌核发育和性逆转技术获得遗传全雌群体,但由于外源因子如高温和睾酮诱导其表型可能会变为雄性,故对牙鲆性腺分化机制进行研究,不仅有利于指导性别控制,还将对丰富鱼类性腺分化理论具有重要意义。目前关于牙鲆性别分子生物学机制研究主要集中于性别相关基因的同源克隆、表达和甲基化水平性别二态性的研究报道,尚缺乏深入研究。本研究从转录组学、基因表达、表观遗传学、内分泌学及基因调控等方面对牙鲆性腺分化机制进行了初步阐述。首先对牙鲆性腺转录组进行分析,筛选两性差异表达基因,为其机制研究提供更多的性腺分化相关候选基因;主要分析了芳香化酶基因cyp19a及其转录因子foxl2(叉头框转录因子L2)、nr5a2(性类固醇生成因子)和nr0b1(性类固醇激素合成拮抗因子)在性腺分化期的表达水平和启动子区甲基化水平的变化规律,结合性类固醇激素水平的变化分析这些基因对牙鲆性腺分化方向的影响;同时研究了foxl2、nr5a2和nr0b1在性腺组织中的表达定位和对cyp19a的调控作用,并对cyp19a启动子区完全甲基化调控其转录活性的机制进行了初步的研究。具体研究结果如下:1.通过雌雄性腺转录组的分析,注释了21,697个基因,发现大量基因参与信号转导、细胞生长与凋亡、内分泌过程等。筛选得到887个雄性高表达基因和2,193个雌性高表达基因,KEGG富集分析显示这些基因参与细胞生长死亡、转录和翻译、能量和物质代谢等过程。经筛选获得性腺分化发育相关基因,这些基因主要参与性腺分化和发育调控、性类固醇激素合成、配子组成和发生,由此预测了卵巢中性类固醇激素合成等途径。2.对cyp19a及其转录因子在牙鲆性腺分化期的实时定量RT-PCR(qPCR)实验结果表明,cyp19a和foxl2在卵巢分化过程中上调表达,高温(28±0.3℃)可以抑制它们的表达,但nr0b1表达上调,而外源雌二醇处理能够显著提高nr5a2在性腺分化早期的表达。在卵巢性腺分化过程中雌二醇水平不断升高,而高温诱导可以降低精巢分化过程中雌二醇水平,提高雄性激素水平。这些基因启动子区CpG岛甲基化水平检测显示,牙鲆cyp19a启动子区CpG岛在卵巢分化早期发生去甲基化,甲基化水平降低;而高温处理抑制了去甲基化过程,其甲基化水平较高;外源雌二醇则能延迟发生去甲基化的时期,但在性腺分化后期诱导重新甲基化,使得其甲基化水平重新升高。foxl2启动子区的CpG岛在卵巢分化后期发生去甲基化,甲基化水平降低,而高温处理抑制了该过程。nr5a2甲基化水平不受高温和雌二醇诱导影响,在性腺分化期始终维持低甲基化水平。3.免疫组化和原位杂交的结果表明,foxl2、nr5a2和nr0b1在卵巢中主要表达在滤泡细胞中,这与cyp19a在卵巢中的表达部位一致;nr5a2和nr0b1在精巢中主要表达在其支持细胞中,但在精原细胞和初级精母细胞也有微弱的表达信号。4.通过HEK 293T细胞瞬时转染实验和精巢支持细胞系中过表达实验分析了各转录因子对cyp19a的调控作用。结果均显示,Nr5a2具有明显激活cyp19a转录活性的作用;EMSA实验结果证明Nr5a2能够结合cyp19a启动子区的两个顺式调控元件,经细胞共转染实验进一步表明,Nr0b1能够抑制Nr5a2介导的cyp19a转录激活,且Nr5a2和Nr0b1在调控cyp19a表达上存在一定的拮抗作用。Foxl2在牙鲆精巢支持细胞过表达则能够提高cyp19a的表达,并具有剂量依赖性,其还能够和Nr5a2共同激活cyp19a的表达。在性腺分化过程中,cyp19a在高温组和对照组的表达水平与启动子区的甲基化水平呈负相关性,体外细胞转染实验证明cyp19a启动子区的完全甲基化抑制转录激活因子Nr5a2的激活作用,且Nr5a2的结合位点正位于cyp19a启动子区CpG岛序列上,因此,cyp19a启动子区的甲基化修饰可能通过阻遏转录因子的结合发挥调控作用。