论文部分内容阅读
裂殖壶菌(Schizochytrium)是目前工业化发酵DHA产量最高的菌株,尽管人们通过发酵优化实现了高密度工业化生产,但对其胞内脂质代谢调控机制还不甚清楚。为进一步了解裂殖壶菌胞内脂质代谢调控机制,本课题以Schizochytrium sp.S31为研究对象,首先进行全基因组测序,筛选分析参与脂代谢的关键酶基因;然后分析不同发酵条件下Schizochytrium sp.S31胞内关键酶基因的转录变化规律,阐述其胞内脂质迁移规律与关键酶基因转录调控的内在联系,以期为进一步利用基因工程手段改造裂殖壶菌,提高DHA产量和改善DHA品质提供理论依据。首先,本研究完成了Schizochytrium sp.S31全基因组测序,对测序原始数据过滤掉低质量片段后,获得18,216,884条高质量reads,共454.5 Mb数据,整体覆盖度121倍。基因组大小为42.99 Mb,GC含量为56.58%。基因组注释结果包括11,404个基因,平均基因长度为1,868.7 bp。利用京都基因及基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)标示了Schizochytrium sp.S31中参与脂肪水解代谢的基因。进一步利用美国国家生物技术中心(National center of biotechnology information,NCBI)数据库比对筛选出其中的3个脂肪酶及3个磷脂酶的基因。其次,本研究分析了Schizochytrium sp.S31在不同温度条件下,胞内参与脂质合成的酶基因转录变化水平。结果表明,在以甘油为碳源进行摇瓶发酵时,细胞25oC培养72 h后进入脂质积累阶段。随后,将发酵温度上调为30oC后,PKS途径产物与FAS途径产物的比值由1.129不断降低至0.758;且温度上调3 h后,FAS基因的转录水平扩大为原来的3倍,而PKS的PFA1亚基的转录水平降低为原来的80%;相反,将发酵温度下调为20oC后,PKS途径的产物与FAS途径产物比值由1.129不断增至1.834,调节温度3 h后,PFA1和PFA3分别增长为原来的9倍及10倍,而FAS基因转录水平增长至原来的3倍。推测Schizochytrium sp.S31的脂质合成是由FAS基因和PKS基因共同转录调控的。再次,本研究利用脂质组学方法系统分析了Schizochytrium sp.S31在不同碳源发酵条件下,发酵后期胞内脂肪酸的迁移规律。结果表明,磷脂脂肪酸的迁移主要集中于在饱和脂肪酸及长链多不饱和脂肪酸,而甘油三酯脂肪酸的迁移主要为C14:0和C16:0。RT-qPCR分析结果表明,SPLA,SPLB和SPLD基因参与调控磷脂的代谢。STGL1,STGL2及STGL3参与甘油三酯的水解。并且STGL1是发酵后期的主要脂肪酶,STGL2及STGL3起辅助作用。最后,本研究对参与磷脂代谢的关键基因SPLB进行了克隆,并成功在毕赤酵母中异源表达,利用卵黄平板法对其磷脂酶活性进行了初步鉴定。